Luận văn Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cây Hedyotis Dichotoma Koen.ex Roth thuộc họ cà phê (Rubiaceae)

Chương 2 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 22 2.1. THU HÁI VÀ XỬ LÝ MẪU Cây An điền lưỡng phân được thu hái ở tỉnh Bình Phước. Cây đã được nhận danh tên khoa học là Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth bởi PGS. TS. Trần Hợp, Khoa Sinh, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. Cây được lưu trong quyển lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu số US-C020, giữ tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. 15 kg cây tươi An điền lưỡng phân được rửa sạch, phơi khô, cắt nhuyễn, thu được bột cây khô 1,64 kg. 2.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột cây khô được trích kiệt bằng etanol theo phương pháp ngâm dầm, lọc, cô quay, thu hồi dung môi, thu được cao etanol thô 100,92 g. Cao etanol thô được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat và metanol. Quy trình điều chế và thu suất các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1 và bảng 2.1. Các cao được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng được trình bày trong hình 2.1. Bảng 2.1: Khối lượng và thu suất các loại cao thu được từ cao etanol ban đầu. Các loại cao Ký hiệu cao Khối lượng (g) Thu suất (%) Eter dầu hỏa E 3,21 3,18 Cloroform A CA 3,91 3,87 Cloroform B CBB 5,49 5,44 Etyl acetat A AA 5,98 5,93 Etyl acetat B AB 0,112 0,11 Etyl acetat C AC 8,96 8,88 Metanol M 50,83 50,37 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 23 Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao từ cây An điền lưỡng phân bằng phương pháp trích pha rắn trên silica gel. Ngâm trích với etanol Lọc, cô quay thu hồi dung môi Giải ly bằng cloroform Cô quay thu hồi dung môi Giải ly bằng eter dầu hỏa Cô quay thu hồi dung môi Giải ly bằng metanol Cô quay thu hồi dung môi Giải ly bằng etyl acetat Cô quay thu hồi dung môi Cao cloroform A (3,91 g) Cao cloroform B (5,49 g) Cao etyl acetat A (5,98 g) Cao etyl acetat B (112 mg) Cao etyl acetat C (8,96 g) Cột còn lại Cột bỏ Bột cây khô (1,64 kg) Cao etanol (100,92 g) Cao eter dầu hỏa (3,21 g) Cột còn lại Cột còn lại Cao metanol (50,83 g) Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 24 (a) (b) Hình 2.1: Sắc kí lớp mỏng các loại cao điều chế theo sơ đồ 2.1 Ghi chú: E: cao eter dầu hỏa CA: cao cloroform A CB: cao cloroform B B M: cao metanol AA: cao etyl acetat A AB: cao etyl acetat B (Hợp chất Dichoto-Ace1) AC: cao etyl acetat C Hệ dung môi giải ly: (a) cloroform : metanol (8:2) (b) cloroform : metanol : nước (14:6:1) Thuốc thử hiện hình: dung dịch H2SO4 50% 2.3. TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY AN ĐIỀN LƯỠNG PHÂN 2.3.1. Sắc kí cột silica gel trên cao cloroform A của sơ đồ 2.1 Cao cloroform A (3,91 g) được sắc kí cột silica gel, giải ly bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ benzen đến metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ (mỗi lọ 100 ml), cô quay. Chấm sắc kí lớp mỏng, các lọ có sắc kí lớp Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 25 mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao cloroform A của sơ đồ 2.1. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng) 1 B 1019,4 Có một vết tròn đen, khảo sát thu được Dichoto-Clo1. 2 B:C (99:1), B:C (98:2) 409,5 Nhiều vết. Không khảo sát. 3 B:C (95:5), B:C (90:10), B:C (80:20), B:C (50:50) 616,7 Nhiều vết. Không khảo sát. 4 C, C:M (90:10), C:M (80:20), M 1025,6 Nhiều vết. Không khảo sát. Ghi chú: B: benzen C: cloroform M: metanol Cao ở phân đoạn 1 của bảng 2.2 có dạng sáp màu vàng xanh, sắc kí lớp mỏng có một vết tròn màu đen nên được chọn khảo sát. Tiến hành sắc kí điều chế nhiều lần, kết tinh lại trong cloroform thu được chất rắn màu trắng, dạng bột. Hợp chất này được ký hiệu là Dichoto-Clo1. Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.2. 2.3.2. Sắc kí cột silica gel trên cao cloroform B của sơ đồ 2.1 Cao cloroform B (5,49 g) được nạp vào đầu cột sắc kí, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ benzen, cloroform đến metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng. Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.3. Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 26 (a) (b) Hình 2.2: Sắc kí lớp mỏng của các hợp chất Dichoto-Clo1, Dichoto-Clo2, Dichoto-Clo3 Ghi chú: CA: cao cloroform A C1: Hợp chất Dichoto-Clo1 C2: Hợp chất Dichoto-Clo2 C3: Hợp chất Dichoto-Clo3 (a) Hệ dung môi giải ly: cloroform : etyl acetat (8:2) Thuốc thử hiện hình: dung dịch H2SO4 50% (b) Hệ dung môi giải ly: etyl acetat Thuốc thử hiện hình: dung dịch FeCl3/EtOH 2.3.2.1. Khảo sát phân đoạn 2 của bảng 2.3 Phân đoạn 2 của bảng 2.3 được sắc kí cột nhiều lần, sắc kí điều chế và kết tinh lại trong cloroform thu được tinh thể hình kim, màu vàng. Hợp chất này được ký Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 27 hiệu là Dichoto-Clo2. Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.2. Bảng 2.3: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao cloroform B của sơ đồ 2.1. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng) 1 B, B:C (99:1), B:C (98:2), B:C (95:5) 319,4 Nhiều vết. Không khảo sát. 2 B:C (90:10), B:C (80:20), B:C (50:50) 179,0 Có một vết chính. Khảo sát thu được Dichoto-Clo2 3 C, C:M (99:1), C:M (98:2), C:M (95:5) 2028,7 Có một vết chính. Khảo sát thu được Dichoto-Clo3 4 C:M (90:10), C:M (80:20), C:M (50:50), M 674,4 Nhiều vết. Không khảo sát. Ghi chú: B: benzen C: cloroform M: metanol 2.3.2.2. Khảo sát phân đoạn 3 của bảng 2.3 Khi cô quay thu hồi dung môi các lọ thuộc phân đoạn 3 của bảng 2.3, thấy xuất hiện kết tủa màu trắng hơi lẫn màu xanh, khối lượng 200,3 mg. Rửa tủa nhiều lần bằng cloroform, sau đó sắc kí cột thu được tinh thể hình kim, màu trắng. Hợp chất này được ký hiệu là Dichoto-Clo3. Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.2. 2.3.3. Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat A của sơ đồ 2.1 Cao etyl acetat A (5,98 g) được nạp vào đầu cột sắc kí, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ cloroform, etyl acetat đến metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng. Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.4. Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 28 Bảng 2.4: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat A của sơ đồ 2.1. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng) 1 C 244,9 Nhiều vết. Không khảo sát. 2 C:A (99:1), C:A (98:2), C:A (95:5) 94,7 Nhiều vết. Không khảo sát. 3 C:A (90:10), C:A (80:20) 490,6 Nhiều vết. Không khảo sát. 4 C:A (50:50) 1331,1 Có một vết màu hồng. Khảo sát thu được Dichoto-Ace1. 5 A, A:M (98:2), A:M (95:5), A:M (90:10) A:M (80:20), M 1918,0 Nhiều vết. Không khảo sát. Ghi chú: A: etyl acetat C: cloroform M: metanol Phân đoạn 4 khi sắc kí lớp mỏng cho vết màu hồng rõ ràng nên được chọn khảo sát tiếp. Tiến hành sắc kí cột nhiều lần phân đoạn 4, sau đó sắc kí điều chế thu được chất rắn màu trắng dạng bột, ký hiệu là Dichoto-Ace1. Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3. 2.3.4. Khảo sát cao etyl acetat B của sơ đồ 2.1 Cao etyl acetat (112 mg) thu được từ sơ đồ 2.1 là chất bột khô màu trắng. Sắc kí lớp mỏng, hiện hình với thuốc thử H2SO4 50%, cao cho thấy có một vết tròn, màu hồng nhưng vết còn hơi bẩn. Tiến hành sắc kí điều chế, giải ly bằng metanol, thu được chất rắn màu trắng (20 mg), hợp chất này được đặt tên là Dichoto-Ace2. Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3. Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 29 (a) (b) (c) Hình 2.3: Sắc kí lớp mỏng hợp chất Dichoto-Ace1, Dichoto-Ace2, Dichoto-Ace3, Dichoto-Ace4, Dichoto-Me1. Ghi chú: A1: Hợp chất Dichoto-Ace1 A2: Hợp chất Dichoto-Ace2 A3: Hợp chất Dichoto-Ace3 A4: Hợp chất Dichoto-Ace4 T: Tủa bảng 2.6 M1: Hợp chất Dichoto-Me1 Hệ dung môi giải ly: (a) cloroform : metanol (8:2) (b) cloroform : metanol : nước (80:18:2) (c) cloroform : metanol : nước (14:6:1) Thuốc thử hiện hình: dung dịch H2SO4 50% 2.3.5. Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat C của sơ đồ 2.1 Cao etyl acetat C (8,96 g) của sơ đồ 2.1 được sắc kí cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ cloroform, etyl acetat đến Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 30 metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng. Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.5. Bảng 2.5: Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat C của sơ đồ 2.1. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng) 1 C, C:M (99:1), C:M (98:2), C:M (95:5) 130,0 Nhiều vết. Không khảo sát. 2 C:M (90:10), C:M (80:20) 189,7 Nhiều vết. Không khảo sát. 3 C:M (80:20) 733,8 Nhiều vết. Không khảo sát. 4 C:M (80:20), C:M (50:50) 2879,0 Nhiều vết rõ rệt, khảo sát. 5 C:M (50:50) 948,0 Khảo sát tủa trắng. 6 M 1018,2 Nhiều vết. Không khảo sát. Ghi chú: C: cloroform M: metanol 2.3.5.1. Khảo sát phân đoạn 4 của bảng 2.5 Sắc kí cột nhiều lần phân đoạn 4 của bảng 2.5 thu được kết tủa màu vàng. Sắc kí lớp mỏng kết tủa này, với dung môi giải ly (cloroform:metanol:nước) (80:18:2), hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, thấy một vết màu đen nhưng còn hơi dơ. Do đó, kết tủa này được sắc kí cột silica gel pha đảo, giải ly bằng dung môi có độ phân cực giảm dần từ hỗn hợp metanol: nước (1:3) đến metanol, thu được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Ace3. Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3. 2.3.5.2. Khảo sát phân đoạn 5 của bảng 2.5 Cô quay phân đoạn 5 của bảng 2.5 thấy xuất hiện kết tủa màu trắng. Rửa tủa nhiều lần bằng metanol, sau đó sắc kí cột pha đảo tủa này, giải ly bằng metanol thu Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 31 được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Ace4. Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.3. 2.3.6. Sắc kí cột silica gel trên cao metanol của sơ đồ 2.1 Tiến hành sắc kí cột silica gel trên cao metanol (50,83 g) của sơ đồ 2.1, giải ly lần lượt bằng các hỗn hợp dung môi (cloroform: metanol: nước) có độ phân cực tăng dần lần lượt theo tỉ lệ (80:18:2), (70:27:3), (14:6:1), (6:4:1). Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 200 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng. Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.6. Phân đoạn 4 của bảng 2.6 xuất hiện kết tủa màu trắng. Lọc tủa ra khỏi dịch trích, rửa tủa nhiều lần bằng metanol, sau đó sắc kí cột pha đảo tủa này. Sắc kí lớp mỏng pha đảo trên tủa này thấy có nhiều vết, trong đó có một vết tròn màu hồng rõ. Vì vậy, tiến hành sắc kí cột pha đảo trên tủa này, giải ly bằng dung môi có độ phân cực giảm dần từ hỗn hợp metanol: nước (1:3) đến metanol, thu được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Me1. Bảng 2.6: Kết quả sắc cột silicagel trên cao metanol của sơ đồ 2.1. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng) 1 C:M:H (80:18:2) 1,99 Vết rõ rệt. Khảo sát sau 2 C:M:H (80:18:2) 1,98 Vết rõ rệt. Khảo sát sau 3 C:M:H (80:18:2) 3,45 Vết rõ rệt. Khảo sát sau 4 C:M:H (70:27:3) 5,35 Xuất hiện tủa trắng. Khảo sát thu được Dichoto-Me1. 5 C:M:H (70:27:3) 9,65 Vết rõ rệt. Khảo sát sau 6 C:M:H (70:27:3), (14:6:1) C:M:H (6:4:1) 12,40 Vệt dài. Không khảo sát. Ghi chú: C: cloroform M: metanol H: nước Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 32 2.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC 2.4.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Clo1 Hợp chất Dichoto-Clo1 thu được từ cao cloroform A có các đặc điểm sau: • Chất bột màu trắng. • Nhiệt độ nóng chảy: 138 oC (kết tinh trong cloroform). • Sắc kí lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung môi cloroform : etyl acetat (8:2), thuốc thử hiện hình là dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản cho một vết màu đen với giá trị Rf = 0,41 (hình 2.2). • Phổ MS (phụ lục 1.1): phổ đồ cho mũi ion phân tử với m/z = 412 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C29H48O (M = 412). • Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 1.2) và so sánh với tài liệu tham khảo [26], (δ ppm): 5,16 (1H, dd, J = 15,0 Hz, J = 8,5 Hz, H22); 5,16 (1H, brs, H7); 5,03 (1H, dd, J = 15,0 Hz, J = 9,0 Hz, H23); 3,59 (1H, m, H3); 2,34 (1H, t, J = 7,5 Hz, H9); 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, H21); 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz, H27); 0,81 (3H, t, J = 7,0 Hz, H29); 0,80 (3H, d, J = 7,0 Hz, H26); 0,80 (3H, s, H19); 0,55 (3H, s, H18). • Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 1.3, 1.4) và so sánh với tài liệu tham khảo [26], (δ ppm): hợp chất có 29 carbon với độ dịch chuyển hóa học trình bày trong bảng 2.7. Biện luận cấu trúc • Phổ 1H-NMR: hợp chất có 3 proton vinyl H7, H22 và H23. Trong đó H22 và H23 ở ghép trans với nhau với hằng số ghép Jtrans = 15,0 Hz. • Phổ 13C-NMR và DEPT có bốn mũi cộng hưởng với độ dịch chuyển hóa học lần lượt là (δ ppm): 139,6 (>C=); 138,2 (=CH-); 129,5 (=CH-); 117,5 (=CH-). Vậy hợp chất Dichoto-Clo1 chứa hai nối đôi trong phân tử. H và H H Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 33 Bảng 2.7: So sánh phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất Dichoto-Clo1 với hợp chất (22E)-5α-stigmasta-7,22-dien-3β-ol (spinasterol). Dichoto-Clo1 (CDCl3, δ ppm) Spinasterol [26] (CDCl3, δ ppm) Vị trí Loại carbon 1H (J, Hz) 13C 1H (J, Hz) 13C 1 -CH2- 37,2 37,2 2 -CH2- 31,5 31,6 3 O-CH< 3,59 (m) 71,1 3,60 (m) 71,1 4 -CH2- 38,0 38,1 5 >CH- 40,3 40,4 6 -CH2- 29,7 29,7 7 =CH- 5,16 (brs) 117,5 5,16 (brs) 117,5 8 >C= 139,6 139,6 9 >CH- 2,34 (t; 7,5 Hz) 49,5 2,34 (t; 7,5 Hz) 49,6 10 >C< 34,3 34,3 11 -CH2- 21,6 21,6 12 -CH2- 39,5 39,6 13 >C< 43,3 43,3 14 >CH- 55,2 55,2 15 -CH2- 23,0 23,1 16 -CH2- 28,5 28,5 17 >CH- 56,0 56,0 18 -CH3 0,55 (s) 12,1 0,55 (s) 12,1 19 -CH3 0,80 (s) 14,1 0,80 (s) 13,1 20 >CH- 40,8 40,8 21 -CH3 1,02 (d; 6,5 Hz) 21,1 1,03 (d; 6,5 Hz) 21,3 22 =CH- 5,16 (dd;15,0; 8,5 Hz) 138,2 5,16 (dd;15,4; 8,5 Hz) 138,2 23 =CH- 5,03 (dd; 15,0; 9,0 Hz) 129,5 5,03 (dd; 15,0; 9,0 Hz) 129,5 24 >CH- 51,3 51,3 25 >CH- 32,0 32,0 26 -CH3 0,80 (d; 7,0 Hz) 19,0 0,80 (d; 6,2 Hz) 19,0 27 -CH3 0,85 (d; 6,5 Hz) 21,4 0,85 (d; 6,2 Hz) 21,4 28 -CH2- 25,4 25,5 29 -CH3 0,81 (t; 7,0 Hz) 12,25 0,81 (t; 7,4 Hz) 12,3 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 34 • So sánh các số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất Dichoto-Clo1 với hợp chất (22E)-5α-stigmasta-7,22-dien-3β-ol (spinasterol) [26] trình bày trong bảng 2.7 thấy có sự tương đồng. Do vậy, Dichoto-Clo1 được đề nghị là 22(E)-5α-stigmasta-7,22-dien-3β-ol (spinasterol). HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 (22E)-5α-Stigmasta-7,22-dien-3β-ol (Dichoto-Clo1) 2.4.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Clo2 Hợp chất Dichoto-Clo2 thu được từ cao cloroform B có các đặc điểm sau: • Tinh thể hình kim màu vàng. • Nhiệt độ nóng chảy: 148 oC (kết tinh trong cloroform). • Sắc kí lớp mỏng: giải ly bằng dung môi etyl acetat, thuốc thử hiện hình là dung dịch FeCl3/EtOH, sấy bản cho một vết màu xanh với giá trị Rf = 0,55 (hình 2.2). • Phổ MS (phụ lục 2.1): phổ đồ cho mũi ion phân tử với m/z = 168 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C8H8O4 (M = 168). • Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 2.2), (δ ppm): 5,85 (2H, s, H3 và H6); 3,82 (2x3H, s, 2 nhóm -OCH3). • Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 2.3, 2.4), (δ ppm): 186,9 (>C=O, C1 và C4); 157,4 (=C-O-, C2 và C5); 107,4 (=CH-, C3 và C6); 56,5 (2 nhóm -OCH3). Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 35 Bảng 2.8: Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất Dichoto-Clo2. Dichoto-Clo2 (CDCl3, δ ppm) Vị trí Loại carbon 1H-NMR 13C-NMR 1, 4 >C=O 186.9 2, 5 =C-O- 157.4 3, 6 =CH- 5,85 (s) 107,4 -OCH3 3,82 (s) 56.5 Từ các dữ liệu phổ ở trên chúng tôi đề nghị hợp chất Dichoto-Clo2 là 2,5- dimetoxybenzoquinon. O O OCH3 H3CO 1 2 345 6 2,5-Dimetoxybenzoquinon Ngoài ra, ở vùng từ trường cao của phổ NMR xuất hiện những tín hiệu của tạp chất, và từ các số liệu dưới đây chúng tôi đề nghị tạp chất đó là octacosan. • MS: tín hiệu tại m/z = 394 tương ứng với khối lượng phân tử của C28H58, octacosan. • 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), (δ ppm): 1,6 – 0,8: proton của nhóm -CH2-, -CH3 của alcan. • 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), (δ ppm): 14,1 (-CH3, C1, C28); 10 – 35 (các carbon CH2). 2.4.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Clo3 Hợp chất Dichoto-Clo3 thu được từ cao cloroform B có các đặc điểm sau: • Tinh thể hình kim màu trắng. • Nhiệt độ nóng chảy: 210 oC (kết tinh trong cloroform : metanol 1:1). Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 36 • Sắc kí lớp mỏng: giải ly bằng dung môi etyl acetat, thuốc thử hiện hình là dung dịch FeCl3/EtOH, sấy bản cho một vết màu xanh đậm với giá trị Rf = 0,49 (hình 2.2). • Phổ MS (phụ lục 3.1): phổ đồ cho thấy mũi ion phân tử với m/z = 168 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C8H8O4 (M = 168). • Phổ 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, 500 MHz) (phụ lục 3.2), (δ ppm): 7,60 (1H, dd, J = 8,5 Hz, J = 1,5 Hz, H6); 7,57 (1H, d, J = 1,5 Hz, H2); 6,87 (1H, d, J = 8,5 Hz, H5); 3,92 (3H, s, -OCH3). • Phổ 13C-NMR (CDCl3 + CD3OD, 125 MHz) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 3.3, 3.4): hợp chất có 8 carbon với độ dịch chuyển hóa học trình bày trong bảng 2.9. • Phổ HSQC (phụ lục 3.5) và HMBC (phụ lục 3.6) cho thấy sự tương quan giữa proton và carbon được trình bày trong bảng 2.9. Bảng 2.9: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Dichoto-Clo3. Dichoto-Clo3 (CDCl3 + CD3OD, δ ppm) Vị trí Loại carbon 1H-NMR (J, Hz) 13C-NMR HMBC (1H → 13C) 1 >C= 122,6 2 =CH- 7,57 (d; 1,5 Hz) 113,2 COOH, C1, C3, C4, C6 3 =C-O- 147,7 4 =C-O- 151,5 5 =CH- 6,87 (d; 8,5 Hz) 115,1 C1, C3, C4 6 =CH- 7,60 (dd; 8,5; 1,5 Hz) 124,8 COOH, C2, C4 -COOH 169,7 -OCH3 3,92 (s) 56,1 C3 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả 37 Biện luận cấu trúc • Phổ 1H-NMR có 3 tín hiệu của proton vòng thơm 7,60 (1H, dd, J = 8,5 Hz, J = 1,5 Hz, H6); 7,57 (1H, d, J = 1,5 Hz, H2); 6,87 (1H, d, J =8,5 Hz, H5). Từ giá trị hằng số ghép J = 1,5 Hz = Jmeta, J = 8,5 Hz = Jorto suy ra: proton H6 ghép orto với H5 và ghép meta với H2. Vì vậy, chúng tôi đề nghị Dichoto-Clo3 là dẫn xuất của benzen mang 3 nhóm thế. H H H 1 2 3 4 5 6 • Phổ 13C-NMR có tín hiệu tại 169,7 ppm là carbon carboxyl của acid carboxylic hoặc ester; tín hiệu tại 151,5 và 147,7 ppm là carbon olefin mang oxygen. Ngoài ra, phổ HMBC cho tương quan giữa proton –OCH3 và carbon 147,7 ppm nên nhóm metoxy gắn vào carbon này. Như vậy, nhóm –OH gắn vào carbon 151,5 ppm, tín hiệu tại 169,7 ppm là của –COOH và còn một carbon olefin tứ cấp 122,6 ppm sẽ mang nhóm -COOH. Vậy Dichoto-Clo3 là dẫn xuất của benzen mang 3 nhóm thế -COOH, -OCH3 và –OH. • Phổ 1H-NMR cho thấy proton H2 và H6 có độ dịch chuyển hóa học cao hơn proton H5 nên nhóm –COOH ở vị trí orto so với H2 và H6. Kết hợp với phổ HMBC,