Luận văn Khảo sát thành phần hóa học cao cloroform cây giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum họ bầu bí (curcubitaceae)

20 2. NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 2.1. Giới thiệu chung: Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của phần trên mặt đất của cây giảo cổ lam, được thu hái ở vùng núi Phan Xi Păng (thuộc dãy núi Hoàng Liên Sơn) vào tháng 9 năm 2006. Mẫu cây được phơi khô, xay nhỏ rồi trích kiệt với metanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, thu hồi dung môi thu được cao metanol thô. Cao metanol đem hòa tan vào nước rồi trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform, n-butanol thu được các cao tương ứng. Trên cao cloroform, thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường và pha đảo nhiều lần với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau chúng tôi đã cô lập được bảy hợp chất, ký hiệu CN1, CN2, CN3, CN4, CN5, CN6 và CN7. Sau đây là phần biện luận để xác định cầu trúc các hợp chất này. 2.2. Biện luận và kết quả: 2.2.1. Hợp chất CN1: Hợp chất CN1 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly eter dầu hỏa-etyl acetat (7:3) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng. 21 Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH 7.68 (1H, dd, J 2.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.08 (1H, d, J 8.5, H-5′) và δH 7.72 (1H, d, J 2.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở δH 6.37 (1H, d, J 2.0, H-6) và δH 6.68 (1H, d, J 2.0, H-8), cho thấy CN1 có hai vòng thơm, một vòng mang ba nhóm thế và một vòng mang bốn nhóm thế. Ngoài ra còn có sự hiện diện của hai nhóm –OCH3 ở δH 3.85 (3H, s), 3.85 (3H, s) và một nhóm –OH kiềm nối ở δH 12.45 (1H, s). Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 17 carbon, trong đó có 10 carbon tứ cấp, năm carbon metin, và hai carbon metyl. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon carbonyl ở δC 176.1 (C-4), 14 carbon vòng thơm và hai carbon sp3. Vậy hợp chất CN1 là một flavonoid có hai nhóm thế -OCH3. Trên phổ HMBC, proton ở δH 6.37 (H-6) và δH 6.68 (H-8) ghép cặp meta với nhau và đều cho tương quan với carbon vòng thơm tứ cấp gắn oxygen ở δC 165.0 và tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 104.0 nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10. Hai proton này cũng lần lượt cho tương quan với hai carbon vòng thơm oxygen hóa ở δC 156.1 và 160.4 nên hai carbon này lần lượt là C-9 và C-5. Proton ở δH 7.68 (H-6′) và δH 7.72 (H-2′) đều cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 123.3 và hai carbon vòng thơm gắn oxygen ở δC 149.5 và δC 146.8; đồng thời proton ở δH 7.08 (H-5′) cho tương quan với carbon ở δC 149.5 mà không cho tương quan với carbon ở δC 146.8 nên ba carbon này lần lượt phải là C-1′ (123.3), C-2 (146.8) và C-4′ (149.5). Bên cạnh đó, tương quan HMBC giữa H-5′ và H-2′ với carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 146.2 khẳng định đây chính là C-3′. Đặc biệt tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở δH 3.85 (6H,s) cho tương quan HMBC lần lượt với C-7 và C-4′, cho thấy hai nhóm –OCH3 lần lượt gắn vào các vị trí này. 22 Hình 1: Tương quan HMBC của CN1 (phụ lục 1.6) Từ những dữ liệu trên kết luận CN1 là 7,4′-dimetylquercetin, còn có tên gọi khác là ombuin, một dẫn xuất dimetyl của quercetin. Hợp chất này đã được công bố trước đây từ cây giảo cổ lam. [13] 23 Báng1: Số liệu phổ 1H-,13C-NMR và HMBC của hợp chất CN1 (DMSO-d6) Vị trí Loại C δ H δ C Tương quan HMBC (1H
13C) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ =C(OR)- =C(OH)- >C=O =C(OH)- =CH- =C(OR)- =CH- =C(OR)- >C= >C= =CH- =C(OH)- =C(OR)- =CH- =CH- 7-OCH3 4′-OCH3 6.37 (d, J 2.0) 6.68 (d, J 2.0) 7.72 (d, J 2.5) 7.08 (d, J 8.5) 7.68 (dd, J 2.5; 8.5) 146.8 136.4 176.1 160.4 97.5 165.0 91.9 156.1 104.0 123.3 114.8 146.2 149.5 111.8 119.8 55.6 56.0 C-5, C-7, C-8, C-10 C-7, C-9, C-6, C-10 C-3′, C-2,C-6′, C-4′ C-2′, C-4′, C-5′ C-4′, C-2′,C-1′,C-3′ C-2′, C-5′, C-2,C-4′ 24 2.2.2. Hợp chất CN2: Hợp chất CN2 được cô lập dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, tan trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng pha đảo giải ly bằng hệ dung ly metanol- nước (1:2) cho vết tròn có Rf 0.5, hấp thu UV, hiện hình bằng hơi iod. Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH 7.57 (1H, dd, J 2.0;8.5, H-6) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 6.98 (1H, d, J 8.5, H-5) và δH 7.45 (1H, d, J 2.0, H-2), cho thấy CN2 có một vòng thơm mang ba nhóm thế. Ngoài ra còn có sự hiện diện của một nhóm –OCH3 ở δH 3.93 (3H, s), và hai nhóm –OH ở δH 4.86. Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của tám carbon, trong đó có bốn carbon tứ cấp, ba carbon metin và một carbon metyl. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon của nhóm ester gắn trên vòng thơm ở δC 170.0. Vậy hợp chất CN2 là một vòng thơm có ba nhóm thế, trong đó có một nhóm là dẫn xuất của acid carboxylic. Trên phổ HMBC, proton ở δH 7.57 (H-6) và δH 7.45 (H-2) ghép cặp meta và đều cho tương quan với carbon carbonyl của acid gắn trên vòng thơm ở δC 170.0 và tương quan với carbon vòng thơm tứ cấp gắn nhóm ester ở δC 124.4, nên carbon này là C-1. Proton ở δH 7.45 (H-2) và δH 6.98 (H-5) đều cho tương quan với hai carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 156.3 và δC 147.3 nên hai carbon này lần lượt là C-4 và C-3. Tín hiệu proton của nhóm metyl ở δH 3.93 (3H, s) cho tương quan HMBC với carbon carbonyl của nhóm acid, cho thấy nhóm –OCH3 gắn trên vị trí này. 25 Hình 2: Tương quan HMBC của CN2 (phụ lục 2.5) Từ những dữ liệu trên kết luận CN2 là metyl 3,4-dihydroxybenzoat. Bảng 2: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất CN2 (MeOH-d4) Vị trí Loại C δ H δ C Tương quan HMBC (1H
13C) 1 2 3 4 5 6 =C< =CH- =C(OH)- =C(OH)- =CH- =CH- -COO- -OCH3 7.45 (d, J 2.0) 6.98 (d, J 8.5) 7.57 (dd, J 2.0; 8.5) 124.4 117.3 147.3 153.3 111.7 123.7 170.0 56.4 C-2, C-4, C-1, C-7 C-5, C-4, C-2 C-2, C-1, C-3 26 2.2.3. Hợp chất CN3: Hợp chất CN3 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform-metanol (9:1) cho vết tròn có Rf 0.3, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng. Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH 8.10 (2H, d, J 8.5, H-2′ và H-6′) ghép cặp ortho với δH 6.91 (2H, d, J 8.5, H-3′ và H- 5′); và hai proton ghép cặp meta ở δH 6.41 (1H, d, J 2.0, H-6) và δH 6.20 (1H, d, J 2.0, H-8) cho thấy CN3 có hai vòng thơm, một vòng thơm mang hai nhóm thế và một vòng thơm mang bốn nhóm thế. Phổ 13C-NMR, DEPT-90 vả DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 15 carbon, trong đó có chín carbon tứ cấp, sáu carbon metin. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon carbonyl ở δC 177.4 (C-4), 14 carbon vòng thơm. Vậy hợp chất CN3 là một flavonoid. Trên phổ HMBC, proton ở δH 6.41 (H-6) và δH 6.20 (H-8) ghép cặp meta với nhau và đếu cho tương quan với carbon tứ cấp gắn oxygen ở δC165.6 và tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 104.6 nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10. Hai proton này cũng lần lượt cho tương quan với hai carbon vòng thơm oxygen hóa ở δC 158.3 và 162.5 nên hai carbon này lần lượt là C-5 và C-9. 27 Proton ở δH 8.10 (H-2′ và H-6′) cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 123.7 và carbon vòng thơm gắn oxygen ở δC 148.1 nên hai carbon này lần lượt là C-1′ và C-2′. Proton ở δH 8.10 (H-2′ và H-6′) và δH 6.91 (H-3′ và H-5′) đều cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 160.5 nên carbon này là C-4′. Hình 3: Tương quan HMBC của CN3 (phụ lục 3.5) Từ những dữ liệu trên kết luận CN3 là 3,4′,5,7-tetrahydroxyflavon hay còn gọi là kaempferol 28 Bảng 3: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất CN3 (MeOH-d4) Vị trí Loại C δH δC Tương quan HMBC (1H
13C) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ =C(OR)- =C(OH)- >C=O =C(OH)- =CH- =C(OH)- =CH- =C(OR)- >C= >C= =CH- =CH- =C(OH)- =CH- =CH- 6.41 (d, J 2.0) 6.20 (d, J 2.0) 8.10 (d, J 8.5) 6.91 (d, J 8.5) 6.91 (d, J 8.5) 8.10 (d, J 8.5) 148.1 137.1 177.4 158.3 94.5 165.6 99.3 162.5 104.6 123.7 116.3 130.7 160.5 130.7 116.3 C-5, C-7, C-8, C-10 C-7, C-9, C-6, C-10 C-3′, C-2, C-6′, C-4′ C-2′, C-4′, C-1′, C-5′ C-4′, C-6′, C-1′, C-3′ C-5′, C-2, C-4′, C-2′ 29 2.2.4. Hợp chất CN4: O O H3CO OCH3 OH O OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Glu Hợp chất CN4 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform-metanol (8:2) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng. Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH 7.73 (1H, dd, J 2.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.06 (1H, d, J 8.5. H-5′) và δH 7.60 (1H, d, J 2.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở δH 6.38 (1H, d, J 2.0, H-6) và δH 6.72 (1H, d, J 2.0, H-8). Ngoài ra còn có sự hiện diện của hai nhóm –OCH3 ở δH 3.86 (3H, s, 7-OCH3), 3.86 (3H, s, 4′-OCH3). Những dữ kiện này cho thấy aglycon của CN4 có cấu trúc của 7,4′-dimetylquercetin, tương tự như CN1. Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR của CN4 còn cho các mũi cộng hưởng của một proton anomer ở δH 5.51 (1H, d, J 7.5, H-1′′). Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 23 ba carbon, trong đó có 15 tín hiệu carbon khung flavonol tương tự như CN1, một carbon metylen và năm carbon metin vùng đường chứng tỏ CN4 có một đơn vị đường là D-glucose. Ngoài ra, CN4 cũng có hai nhóm thế -OCH3 ở δC 56.1 và δC 55.7. Phổ COSY và HSQC xác nhận một đơn vị đường là D-glucose. Phổ HMBC của CN4 còn cho thấy proton anomer của đơn vị đường ở δH 5.51 (H-1′′) cho 30 tương quan với δC 133.8 (C-3). Như vậy, đơn vị đường D-glucose gắn tại vị trí C-3 của aglycon. Từ những dữ liệu trên kết luận CN4 là 7,4′-dimetylquercetin-3-O-β-D- glucopyranosid. Hình 4: Tương quan HMBC của CN4 (phụ lục 4.6) 31 Bảng 4: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất CN4 (DMSO-d6) Vị trí Loại C δH δC Tương quan HMBC (1H
13C) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ Glu 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ =C(OR)- =C(OR)- >C=O =C(OH)- =CH- =C(OR)- =CH- =C(OR)- >C= >C= =CH- =C(OH)- =C(OR)- =CH- =CH- 7-OCH3 4′-OCH3 >CH(OR)(OR′) >CH(OH)- >CH(OH) >CH(OH)- >CH(OR)- -CH2-OH 6.38 (d, J 2.0) 6.72 (d, J 2.0) 7.60 (d, J 2.5) 7.06 (d, J 8.5) 7.73 (dd, J 2.5; 8.5) 5.51 (d, J 7.5) 3.23 (m) 3.24 (m) 3.09 (m) 3.25 (m) 3.60 (dd, J 11.5); 3.33 (m) 156.3 133.8 177.6 160.9 97.9 165.2 92.2 156.2 105.1 122.5 115.8 145.9 150.1 111.4 121.5 56.1 55.7 100.7 74.1 76.5 70.0 77.6 61.0 C-5, C-7, C-8, C-10 C-7, C-9, C-6, C-10 C-1′, C-3′, C-2, C-4′, C-6′ C-4′, C-1′, C-3′, C-6′ C-2′, C-4′, C-2 32 2.2.5. Hợp chất CN5: Hợp chất CN5 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi metanol , sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform-metanol-nước (8:2:0.2) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu vàng. Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH 7.73 (1H, dd, J 1.5; 8.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.05 (1H, d, J 8.5. H-5′) và δH 7.53 (1H, d, J 1.5, H-2′); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở δH 6.37 (1H, d, J 1.5, H-6) và δH 6.68 (1H, d, J 1.5, H-8). Phổ 1H-NMR của CN5 còn xác nhận sự hiện diện của hai nhóm –OCH3 ở δH 3.86 (3H, s, 7-OCH3) và δH 3.86 (3H, s, 4′-OCH3). Những dữ kiện trên cho thấy aglycon của CN5 có cấu trúc 7,4′- dimetylquercetin tương tự như CN1 và CN4. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho các mũi cộng hưởng của hai proton anomer ở δH 4.39 (1H, br.s, H-1′′′), δH 5.40 (1H, d, J 7.5, H-1′′) và sự hiện diện nhóm metyl –CH3 của một đơn vị đường deoxymannose ở δH 0.98 (3H, d, J 6.0, H3-6′′′) Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 29 carbon, trong đó có 17 tín hiệu carbon của aglycon tương tự CN1 và CN4, một tín hiệu carbon metylen, một nhóm metyl của đường α-L-rhamnose và 10 tín hiệu carbon metin vùng đường, chứng tỏ CN5 có hai đơn vị đường là D-glucose và L-rhamnose. 33 Sử dụng phổ COSY, HSQC cho phép xác định hai đơn vị đường chính là β-D-glucose và α-L-rhamnose. Ngoài ra, phổ HMBC của CN5 còn cho thấy hai proton anomer của các đơn vị đường ở δH 5.51 (H-1′′), δH 4.39 (H-1′′′) lần lượt cho tương quan với δC 133.8 (C-3), δC 66.9 (C-6′′). Như vậy, đường D-glucose sẽ gắn trên khung flavonol tại vị trí C-3 và đường L-rhamnose sẽ gắn trên đường glucose tại vị trí C-6′′. Hình 5: Tương quan HMBC của CN5 (phụ lục 5.6) Từ những dữ liệu trên kết luận CN5 là 7,4′-dimetylrutin-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl(1
2)][α-L-rhamnopyranosyl(1
6)]-β-D-glucopyranosid, còn có tên gọi khác là ombuosid. Hợp chất này đã được công bố trước đây từ cây giảo cổ lam.[13, 22] 34 Bảng5: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất CN5 (DMSO-d6) Vị trí Loại C δH δC Tương quan HMBC (1H
13C) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ Glu 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ Rha 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ =C(OR)- =C(OR)- >C=O =C(OH)- =CH- =C(OR)- =CH- =C(OR)- >C= >C= =CH- =C(OH)- =C(OR)- =CH- =CH- 7-OCH3 4′-OCH3 >CH(OR)(OR′) >CH(OH)- >CH(OH) >CH(OH)- >CH(OR)- -CH2-OH >CH(OR)(OR′) >CH(OH)- >CH(OH)- >CH(OH)- >CH(OR)- -CH3 6.38 (d, J 2.0) 6.72 (d, J 2.0) 7.60 (d, J 2.5) 7.06 (d, J 8.5) 7.73 (dd, J 2.5; 8.5) 5.51 (d, J 7.5) 3.23 (m) 3.24 (m) 3.09 (m) 3.25 (m) 3.60 (dd, J 11.5); 3.33 (m) 4.39 (s) 3.41 (br.s) 3.33 (m) 3.06 (m) 3.27 (m) 0.97 (d, J 6.0) 156.7 133.8 177.5 160.9 98.0 165.2 92.3 156.4 105.0 122.5 115.8 145.9 150.1 111.3 121.5 56.1 55.6 101.2 74.0 76.4 69.8 75.8 66.9 100.8 70.6 70.4 71.8 68.2 17.7 C-5, C-7, C-8, C-10 C-7, C-9, C-6, C-10 C-1′, C-3′, C-2, C-4′, C-6′ C-4′, C-1′, C-3′, C-6′ C-2′, C-4′, C-2 35 2.2.6. Hợp chất CN6: Hợp chất CN6 được cô lập dưới dạng bột màu trắng, tan trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng pha đảo giải ly bằng hệ dung ly metanol-nước (3:1) cho vết tròn có Rf 0.3, không hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 25% và đun nóng, xuất hiện vết tròn màu tím đen. Phổ 1H-NMR của CN6 xuất hiện bảy tín hiệu mũi đơn ứng với bảy nhóm metyl của một triterpen ở δH 0.71 (3H, s, H3-19), 0.85 (3H, s, H3-18), 0.91 (3H, s, H3-30), 1.06 (3H, s, H3-29), 1.15 (3H, s, H3-28), 1.55 (3H, s, H3-27), 1.64 (3H, s, H3-26), một tín hiệu mũi đôi vùng trường thấp của nối đôi tại δH 5.37 (1H, d, H-24), một mũi đôi đặc trưng cho nhóm metyl của đơn vị đường α-L-rhamnose tại δH 1.57 (3H, d, J 6.0, H3-6′′), một tín hiệu của nhóm –OCH3 ở δH 3.55 (3H, s) và ba tín hiệu proton anomer của ba đơn vị đường ở δH 4.85 (1H, d, J 5.0, H-1′), δH 5.03 (1H, d, J 8.0, H-1′′′) và δH 6.04 (1H, s, H-1′′). Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho tất cả 48 tín hiệu carbon, trong đó có chín carbon metyl, 11 carbon metylen, 22 carbon metin và sáu carbon tứ cấp. Bảy tín hiệu carbon metyl triterpen ở δC 15.5 (C-18), 16.3 (C-19), 16.3 (C-30), 16.7 (C-29), 18.0 (C-27), 25.5 (C-26), 27.9 (C-28), một tín hiệu carbon metyl của đường α-L-rhamnose ở δC 18.3 (C-6′′), một tín hiệu carbon metyl của nhóm –OCH3 ở 36 δC 55.5, hai tín hiệu carbon vùng trường thấp của nối đôi ở δC 125.9 (C-24), 135.3 (C- 25), bốn tín hiệu carbon phần aglycon gắn với oxygen ở δC 73.8 (C-23), 82.8 (C-20), 88.1 (C-3), 107.4 (C-21). Ngoài ra, còn có tín hiệu của mười bảy carbon của các đơn vị đường, trong đó có ba tín hiệu của carbon anomer ở δC 101.5 (C-1′′), 104.2 (C-1′′′) và 104.5 (C-1′), cho thấy CN6 có ba đơn vị đường. Kết hợp phổ COSY và HSQC, xác định được các vị trí cộng hưởng của proton và carbon của ba đơn vị đường này. Phổ HMBC cho thấy các tín hiệu của nhóm metyl ở δH 0.85, 0.91 cùng cho tương quan với hai carbon tứ cấp, trong khi đó proton metyl ở δH 0.71 cho tương quan với hai carbon metin ở δC 50.8 (C-9) và δC 56.4 (C-5). Do đó, ba nhóm metyl này lần lượt là H3-30 (δH 0.91), H3-18 (δH 0.85) và H3-19 (δH 0.71). Tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở δH 1.06 và δH 1.15 cho tương quan HMBC với các tín hiệu carbon của nhau và tương quan với cùng một carbon tứ cấp ở δC 39.60, như vậy các metyl này phải là H3-28 (δH 1.15) và H3-29 (δH 1.06). Tương tự, xác định được H3-26 (δH 1.64) và H3-27 (δH 1.55) nhờ tương quan giữa các tín hiệu proton và carbon của nhau và đều cho tương quan với hai carbon olefin tam cấp C-24 (δC 125.9) và tứ cấp C-25 (δC 135.3). Vậy hai nhóm metyl này cùng gắn trên một carbon của một nối đôi C=C. Phổ HMBC cho tương quan giữa proton ở δH 2.24 (2H, m, H-22) với carbon tứ cấp gắn oxygen ở δC 82.8 và cũng cho tương quan với carbon metin gắn oxygen ở δC 107.4, δC 73.8 nên ba carbon này lần lượt là C-20, C-21 và C-23. Bên cạnh đó, proton ở δH 5.39 (H-24) còn cho tương quan với carbon nối đôi ở δC 125.9, cho thấy nối đôi C=C lần lượt là C-24 và C-25. Từ những dữ liệu trên cho thấy CN6 là một triterpen saponin có khung dammaran. 37 Sự hiện diện của một nhóm –OCH3 tại C-21 được chứng minh bằng tương quan HMBC của nhóm –OCH3 với C-21 (δC 107.4). Tương quan HMBC giữa H-21 và C-23 cho thấy có eter vòng giữa hai carbon này. O H3CO HO H 3 4 5 29 28 19 18 30 22 27 24 O OH O1'2' 3' O O OH HO HO OH 1''' H O O OH HO HO 1'' H H 21 23 25 2 6 20 Hình 6: Tương quan HMBC của CN6 (phụ lục 6.6) Hình 7: Tương quan ROESY của CN6 (phụ lục 6.7) 38 Phổ HMBC cho tương quan giữa proton anomer ở δH 4.85 (1H, d, J 5.0, H-1′) của đơn vị đường L-arabinose và C-3 (δC 88.1), tương quan giữa proton anomer ở δH 6.04 (1H, s, H-1′′) của đơn vị đường L-rhamnose và proton anomer ở δH 5.03 (1H, d, J 8.0, H-1′′′) của đơn vị đường D-glucose còn lại lần lượt với C-2′ và C-3′ của đơn vị đường L-arabinose. Như vậy, CN6 có ba đơn vị đường gắn tại vị trí C-3 theo thứ tự như trên. Từ những dữ liệu trên, kết luận CN6 chính là (23S)-21-O-metyl-3β,20,21-trihydroxy-21,23-epoxydammar-24-en-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl(1
2)][β-D-glucopyranosyl(1
3)]-α-L-arabinopyranosid. Tra cứu trên SciFinder vào tháng 8/2010 cho thấy CN6 là một cấu trúc chưa được công bố trên thế giới. 39 Bảng 6: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất CN6 (piridin-d5) Vị trí Loại C δH δC Tương quan HMBC (1H
13C) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 -CH2- -CH2- >CH(OR)- >C< >CH- -CH2- -CH2- >C< >CH- >C< -CH2 -CH2- >CH- >C< -CH2- -CH2- >CH- -CH3 -CH3 >C< >CH- -CH2- >CH- =CH- =C< -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -OCH3 1.50 (m); 0.80(m) 1.94 (m); 1.32(m) 3.23 (dd) 0.69 (m) 1.42 (m); 1.32(m) 1.46(m); 1.20(m) 1.25(m) 1.39(m); 1.11(m) 1.76(m); 1.59(m) 1.98 (m) 1.59(m); 1.13 (m) 2.00 (m); 1.25(m) 1.79(m) 0.85 (s) 0.69 (s) 4.88 (s) 2.22(m); 1.71(m) 5.17(m) 5.37 (d) 1.64 (s) 1.55 (s) 1.15 (s) 1.06 (s) 0.91 (s) 3.55 (s) 39.4 26.6 88.1 39.6 56.4 18.3 35.5 40.5 50.8 36.9 22.4 24.9 42.1 50.2 31.1 26.3 48.9 15.5 16.3 82.8 107.4 46.2 73.8