Luận văn Khảo sát thành phần hóa học cây Giảo cổ lam Gynostemma Pentaphyllum, họ bầu bí (Cucurbitaceae)

Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -17- CBHD: TS. Trần Lê Quan 3. NGHIÊN CỨU 3.1 Giới thiệu chung Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của phần trên mặt đất của cây giảo cổ lam, được thu hái ở vùng núi Phanxipang (thuộc dãy núi Hoàng Liên Sơn) vào tháng 9 năm 2006 do công ty TNHH Tuệ Linh (Cầu Giấy, Hà Nội) cung cấp, đã được nhận danh bởi GS.NGND Vũ Văn Chuyên. Mẫu cây được phơi khô, xay nhỏ rồi trích kiệt với metanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, thu hồi dung môi thu được cao metanol thô. Cao metanol đem hòa tan vào nước rồi trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform, n- butanol thu được các cao tương ứng. Trên cao butanol, thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau chúng tôi đã cô lập được sáu hợp chất, ký hiệu BM1, BM2, BM3, BM4, BM5, BM6. 3.2 Biện luận và kết quả Bằng các phương pháp phổ nghiệm như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-NMR, COSY, NOESY, HSQC, HMBC, và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS, cấu trúc các hợp chất đã được xác định là 7,4¢-dimetylquercetin-3-O-[a-L- rhamnopyranosyl(1®6)]-b-D-glucopyranosid (ombuosid, BM1), 7,4¢- dimetylkaempferol-3-O-[a-L-rhamnopyranosyl(1®6)]-b-D-glucopyranosid (BM2), 7,4¢-dimetylquercetin-3-O-[a-L-rhamnopyranosyl(1®2)][a-L- rhamnopyranosyl(1®6)]-b-D-glucopyranosid (BM3), (20S)-3b,20,21-trihydroxy-3- O-[a-L-rhamnopyranosyl(1®2)][b-D-glucopyranosyl(1®3)]-a-L- arabinopyranosyldammar-24-en-21-O-b-D-glucopyranosid (BM4), (20S)- 3b,20,21,25-tetrahydroxy-3-O-[a-L-rhamnopyranosyl(1®2)][b-D- glucopyranosyl(1®3)]-a-L-arabinopyranosyldammaran-21-O-b-D-glucopyranosid (BM5) và (20S)-3b,20,21x,23x,25-pentahydroxy-21,24x-cyclodammaran-3-O-[a- L-rhamnopyranosyl(1®2)][b-D-glucopyranosyl(1®3)]-a-L-arabinopyranosid Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -18- CBHD: TS. Trần Lê Quan (BM6). Trong đó, BM4 là chất lần đầu tiên cô lập được từ cây giảo cổ lam. Riêng BM2, BM3, BM5 và BM6 là bốn chất mới lần đầu tiên được công bố trên thế giới. Các hợp chất BM1-3 đã được thử nghiệm độc tính tế bào đối với một số tế bào ung thư như ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư phổi NCI-H460. 3.2.1 Hợp chất BM1 Hợp chất BM1 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước (8:2:0.2) cho vết tròn có Rf 0.3, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu vàng cam. Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH 7.73 (1H, dd, J 1.5; 8.5, H-6¢) lần lượt ghép cặp ortho và meta với δH 7.05 (1H, d, J 8.5, H-5¢) và δH 7.53 (1H , d, J 1.5, H-2¢); và hai proton ghép cặp meta với các proton ở δH 6.37 (1H, d, J 1.5, H-6) và δH 6.68 (1H, d, J 1.5, H-8), cho thấy BM1 có hai vòng thơm, một vòng mang ba nhóm thế và một vòng mang bốn nhóm thế. Ngoài ra còn có sự hiện diện của hai nhóm -OCH3 ở δH 3.86 (6H, s) và một nhóm - OH kiềm nối ở δH 12.54 (1H, s), các mũi cộng hưởng của hai proton anomer ở δH 4.39 (1H, br.s, H-1′″), δH 5.40 (1H, d, J 7, H-1″) và sự hiện diện nhóm metyl của một đơn vị đường deoxymannose ở dH 0.98 (3H, d, J 6, H3-6′″). Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng của 29 carbon, trong đó có mười carbon tứ cấp, 15 carbon metin, một carbon metylen và ba carbon metyl. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học xác định được có một carbon carbonyl ở δC 177.5 (C-4), 14 carbon vòng thơm và 14 carbon sp3. Vậy BM1 là một flavonoid glycosid có hai đơn vị đường và hai nhóm thế -OCH3. Trên phổ HMBC, proton ở δH 6.37 (H-6) và δH 6.68 (H-8) ghép cặp meta với nhau và đều cho tương quan với carbon vòng thơm tứ cấp gắn oxygen ở δC Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -19- CBHD: TS. Trần Lê Quan 165.1 và tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 105.0 nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-10. Hai proton này cũng lần lượt cho tương quan với hai carbon vòng thơm oxygen hóa ở dC 156.4 và 160.9 nên hai carbon này lần lượt là C-9 và C-5. Proton ở δH 7.54 (H-2′) và δH 7.73 (H-6′) đều cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm không gắn oxygen ở δC 122.4 và hai carbon vòng thơm gắn oxygen ở δC 156.7 và δC 150.1; đồng thời proton ở δH 7.04 (H-5¢) cho tương quan với carbon ở δC 150.1 mà không cho tương quan với carbon ở δC 156.7 nên ba carbon này lần lượt phải là C-1′ (122.4), C-2 (156.7) và C-4′ (150.1). Bên cạnh đó, tương quan HMBC giữa H-2′ và H-5′ với carbon tứ cấp vòng thơm gắn oxygen ở δC 145.9 khẳng định đây chính là C-3′. Đặc biệt, tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở δH 3.86 (6H, s) cho tương quan HMBC lần lượt với C-7 và C-4′ cho thấy hai nhóm -OCH3 lần lượt gắn trên các vị trí này. Sử dụng phổ COSY, HSQC cho phép xác định hai đơn vị đường chính là β-D-glucose và α-L-rhamnose. Ngoài ra, phổ HMBC có các tín hiệu cộng hưởng cho thấy có sự tương quan của H-1² ở δH 5.4 (d, J 7.0) với C-3 (δC 133.8), H- 1′″ ở δH 4.39 (s) tương quan với C-6″ (δC 66.9). Như vậy đường D-glucose sẽ gắn trên khung flavonol tại vị trí C-3 và đường L-rhamnose sẽ gắn trên đường glucose tại vị trí C-6² Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -20- CBHD: TS. Trần Lê Quan O OCH3 OOH H3CO O OH HO O O O HO HO OH OH OH H H 1''' 6'' 1'' 3 H H H H H 2 1' 2' 3' 4' 5' 6' 9 10 5 6 7 8 Töông quan HMBC Từ những dữ liệu trên kết luận BM1 là 7,4¢-dimetylquercetin-3-O-[a- L-rhamnopyranosyl(1®6)]-b-D-glucopyranosid, còn có tên gọi khác là ombuosid, một dẫn xuất dimetylrutin của rutin. Hợp chất này đã được công bố trước đây từ cây giảo cổ lam [6], [25] Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -21- CBHD: TS. Trần Lê Quan Bảng 1: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất BM1 Vị trí Loại C dH dC Tương quan HMBC (1H ® 13C) 2 =C(OR)- 156.7 3 =C(OR)- 133.8 4 >C=O 177.5 5 =C(OH)- 160.9 6 =CH- 6.37 (d, J 1.5) 97.9 C-5, C-7, C-8, C-10 7 =C(OR)- 165.1 8 =CH- 6.68 (d, J 1.5 ) 92.2 C-7, C-9, C-6, C-10 9 =C(OR)- 156.4 10 >C= 105.0 1¢ >C= 122.4 2¢ =CH- 7.54 (d, J 1.5) 115.8 C-3¢, C-2, C-4¢, C-6¢ 3¢ =C(OH)- 145.9 C-2¢, C-4¢, C-1¢, C-5¢ 4¢ =C(OR)- 150.1 5¢ =CH- 7.04 (d, J 8.5 ) 111.3 C-4¢, C-6¢, C-1¢, C-3¢ 6¢ =CH- 7.73 (dd, J 1.5; 8.5) 121.5 C-5¢, C-2, C-2¢, C-4¢ 7-OCH3 3.86 (s) *56.1 C-7 4¢-OCH3 3.86 (s) *55.6 C-4¢ 5-OH 12.54 (s) Glu 1² >CH(OR)(OR¢) 5.40 (d, J 7.0) 101.2 C-3 2² >CH(OH)- 3.23 (m) 74.0 3² >CH(OH)- 3.24 (m) 76.4 4² >CH(OH)- 3.09 (m) 69.8 5² >CH(OR)- 3.25 (m) 75.8 6² –CH2-OR 3.71 (d, J 11.0); 3.33 (m) 66.9 Rha 1′″ >CH(OR)(OR¢) 4.39 (s) 100.7 C-6² 2′″ >CH(OH)- 3.41 (br.s) 70.6 3′″ >CH(OH)- 3.33 (m) 70.4 4′″ >CH(OH)- 3.06 (m) 71.8 5′″ >CH(OR)- 3.27 (m) 68.2 6′″ –CH3 0.97 (d, J 6.0) 17.7 * Hai tín hiệu có thể hoán đổi cho nhau Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -22- CBHD: TS. Trần Lê Quan 3.2.2 Hợp chất BM2 Hợp chất BM2 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước (8:2:0.2) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu vàng cam. Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS của BM3 cho mũi ion giả phân tử [M+H]+ ở m/z 623.1970 (lý thuyết 623.1976) cho thấy BM3 có CTPT C29H34O15. Phổ của BM2 cho thấy có nhiều điểm tương tự phổ của BM1. Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cũng cho các mũi cộng hưởng với sự hiện diện của 29 carbon với 15 tín hiệu của khung flavonol, hai tín hiệu nhóm thế metyl gắn với oxygen ở δC 55.1 và δC 55.4, hai tín hiệu carbon metin gắn với oxygen vùng trường thấp ở δC 100.8 và δC 101.3, chín tín hiệu carbon metin của các đơn vị đường và với sự hiện diện nhóm metyl của đường a-L-rhamnose ở δC 17.7 chứng tỏ BM2 là một flavonol glycosid có hai đơn vị đường L-rhamnose và D-glucose với hai nhóm thế -OCH3 tương tự như BM1. Phổ 1H-NMR cho các mũi cộng hưởng của hai proton hương phương ở δH 8.12 (2H, d, J 8.5, H-2¢ và H-6¢) ghép cặp ortho với hai proton ở δH 7.07 (2H, d, J 9.0, H-3¢ và H-5¢); và proton ở δH 6.39 (1H, d, J 2.0, H-6) ghép cặp meta với proton ở δH 6.72 (1H, d, J 2.0, H-8) cho thấy BM2 có vòng thơm A mang bốn nhóm thế và vòng thơm B mang hai nhóm thế. Phổ proton xác nhận sự hiện diện của hai nhóm -OCH3 ở δH 3.86 (6H, s), một nhóm -OH kiềm nối ở δH 12.50 (1H, s), hai proton anomer ở δH 4.39 (1H, br.s, H-1′″), δH 5.37 (1H, d, J 7.5, H-1²) và sự hiện diện nhóm metyl của đường a-L-rhamnose ở dH 0.97 (3H, d, J 6, H3-6′″). Những dữ liệu này cho thấy aglycon của BM2 có cấu trúc kaempferol. Phổ HMBC cho thấy có sự tương quan của H-1² ở δH 5.37 (d, J 7.5) với C-3 (δC 133.8), H-1′″ ở δH 4.39 (s) tương quan với C-6″ (δC 66.8) xác nhận đơn vị đường D-glucose gắn với C-3 của aglycon và đơn vị đường L-rhamnose gắn với Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -23- CBHD: TS. Trần Lê Quan đường D-glucose ở vị trí C-6². Tương quan HMBC giữa proton của -OH kiềm nối với δC 160.9 khẳng định đây là C-5. Đồng thời, proton ở δH 6.39 cho tương quan với C-5 nên đây chính là H-6. Ngoài ra, proton của hai nhóm -OCH3 cho tương quan HMBC với C-4′ (δC 161.3), C-7 (δC 165.2) xác định vị trí của hai nhóm thế này. Từ những dữ liệu trên chứng tỏ BM2 là 7,4¢-dimetylkaempferol-3-O- [a-L-rhamnopyranosyl(1®6)]-b-D-glucopyranosid. Theo tra cứu trên SciFinder vào tháng 01 năm 2010, BM2 là một cấu trúc chưa từng được công bố trên thế giới. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -24- CBHD: TS. Trần Lê Quan Bảng 2: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất BM2 Vị trí Loại C dH dC Tương quan HMBC (1H ® 13C) 2 =C(OR)- 156.8 3 =C(OR)- 133.8 4 >C=O 177.6 5 =C(OH)- 160.9 6 =CH- 6.39 (d, J 2.0) 98.0 C-5, C-7, C-8, C-10 7 =C(OR)- 165.2 8 =CH- 6.72 (d, J 2.0) 92.4 C-7, C-9, C-6, C-10 9 =C(OR)- 156.5 10 >C= 105.1 1¢ >C= 122.3 2¢ =CH- 8.12 (d, J 8.5) 130.8 C-3¢, C-2, C-4¢, C-6¢ 3¢ =CH- 7.07 (d, J 9.0) 113.7 C-2¢, C-4¢, C-1¢, C-5¢ 4¢ =C(OR)- 161.3 5¢ =CH- 7.07 (d, J 9.0) 113.7 C-4¢, C-6¢, C-1¢, C-3¢ 6¢ =CH- 8.12 (d, J 8.5) 130.8 C-5¢, C-2, C-2¢, C-4¢ 7-OCH3 3.86 (s) *55.4 C-7 4¢-OCH3 3.86 (s) *55.1 C-4¢ 5-OH 12.50 (s) Glu 1² >CH(OR)(OR¢) 5.37 (d, J 7.5) 101.3 C-3 2² >CH(OH)- 3.17 (m) 74.1 3² >CH(OH)- 3.22 (m) 76.3 4² >CH(OH)- 3.10 (m) 69.8 5² >CH(OR)- 3.26 (m) 75.7 6² –CH2(OR) 3.70 (d, J 10.5); 3.33 (m) 66.8 Rha 1²¢ >CH(OR)(OR¢) 4.39 (br.s) 100.8 C-6² 2²¢ >CH(OH)- 3.43 (m) 70.3 3²¢ >CH(OH)- 3.29 (m) 70.6 4²¢ >CH(OH)- 3.09 (m) 71.8 5²¢ >CH(OR)- 3.26 (m) 68.2 6²¢ –CH3 0.97 (d, J 6) 17.7 * Hai tín hiệu có thể hoán đổi cho nhau Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -25- CBHD: TS. Trần Lê Quan 3.2.3 Hợp chất BM3 Hợp chất BM3 được cô lập dưới dạng bột màu vàng, tan tốt trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung ly cloroform:metanol:nước (10:4:1) cho vết tròn có Rf 0.4, hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu vàng cam. Khối phổ phân giải cao (–)-HR-ESI-MS của BM3 cho mũi ion giả phân tử [M–H]– ở m/z 783.2353 (lý thuyết 783.2348) cho thấy BM3 có CTPT C35H44O20. Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho các mũi cộng hưởng với sự hiện diện của 35 carbon, trong đó 15 tín hiệu carbon khung flavonol tương tự như BM1 và BM2, ba tín hiệu carbon metin gắn oxygen vùng trường thấp ở δC 100.6, δC 102.3, δC 102.4, một tín hiệu carbon metylen và 12 tín hiệu carbon metin vùng đường với hai nhóm metyl của đường a-L-rhamnose cùng ở δC 18.3 chứng tỏ BM3 có ba đơn vị đường là D-glucose và hai đường L-rhamnose. Ngoài ra, BM3 cũng có hai nhóm thế -OCH3 ở δC 55.7 và δC 55.8. Phổ 1H-NMR của BM3 xác nhận các mũi cộng hưởng của proton hương phương ở δH 8.35 (1H, dd, J 8.5; 2.5, H-6′) lần lượt ghép cặp ortho và meta với proton ở δH 7.19 (1H, d, J 8.5, H-5′) và δH 8.20 (1H, d, J 2.5, H-2′); proton ở δH 6.48 (1H, d, J 2.5, H-8) ghép cặp meta với proton ở δH 6.44 (1H, d, J 2.5, H-6). Phổ 1H-NMR của BM3 còn xác nhận sự hiện diện của hai nhóm -OCH3 ở δH 3.68 (3H, s, 7-OCH3) và 3.77 (3H, s, 4¢-OCH3). Những dữ kiện này cho thấy algycon của BM3 có cấu trúc của dimetylquercetin tương tự như BM1. Ngoài ra, phổ 1H-NMR của BM3 còn cho các mũi cộng hưởng của ba proton anomer ở δH 6.38 (1H, d, J 8.0, H-1²), δH 6.40 (1H, br.s, H-1²¢), δH 5.19 (1H, br.s, H-1²²) và hai mũi metyl của Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -26- CBHD: TS. Trần Lê Quan đường a-L-rhamnose ở δH 1.62 (3H, d, J 6.5, H3-6²¢) và δH 1.39 (3H, d, J 5.5, H3- 6²²). Phổ COSY và HSQC xác nhận ba đơn vị đường tương ứng là D- glucose và hai đường L-rhamnose. Phổ HMBC của BM3 còn cho thấy ba proton anomer của các đơn vị đường ở δH 6.38 (H-1²), δH 6.40 (H-1²¢), δH 5.19 (H-1²²) lần lượt cho tương quan với δC 134.8 (C-3), δC 78.5 (C-2²) và δC 68.0 (C-6²). Như vậy, đơn vị đường D-glucose gắn tại vị trí C-3 của aglycon và hai đơn vị đường L- rhamnose gắn trên đơn vị D-glucose này lần lượt tại các vị trí C-2² và C-6². Từ những dữ liệu trên kết luận BM3 là 7,4¢-dimetylquercetin-3-O-[a- L-rhamnopyranosyl(1®2)][a-L-rhamnopyranosyl(1®6)]-b-D-glucopyranosid. Theo tra cứu trên SciFinder vào tháng 01 năm 2010, BM3 là một cấu trúc chưa từng được công bố trên thế giới. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -27- CBHD: TS. Trần Lê Quan Bảng 3: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC của hợp chất BM3 Vị trí Loại C dH dC Tương quan HMBC (1H ® 13C) 2 =C(OR)- 158.0 3 =C(OR)- 134.8 4 >C=O 178.6 5 =C(OH)- 157.3 6 =CH- 6.44 (d, J 2.0) 92.3 C-5, C-7, C-8, C-10 7 =C(OR)- 165.6 8 =CH- 6.48 (d, J 2.0) 98.4 C-7, C-9, C-6, C-10 9 =C(OR)- 162.4 10 >C= 106.5 1¢ >C= 124.3 2¢ =CH- 8.20 (d, J 2.5) 117.1 C-1¢, C-3¢, C-2, C4¢, C-6¢ 3¢ =C(OH)- 147.7 4¢ =C(OR)- 151.0 5¢ =CH- 7.19 (d, J 8.5) 111.9 C-4¢, C-6¢, C-1¢, C-3¢ 6¢ =CH- 8.35 (dd, J 2.5; 8.5) 122.6 C-5¢, C-2, C-2¢, C-4¢ 7-OCH3 3.68 (s) 55.8 C-7 4¢-OCH3 3.77 (s) 55.7 C-4¢ Glu 1² >CH(OR)(OR¢) 6.38 (d, J 8.0) 102.3 C-3 2² >CH(OR)- 4.53 (dd, J 8.0; 9.0) 78.5 3² >CH(OH)- 4.32 (m) 79.0 4² >CH(OH)- 3.97 (m) 71.7 5² >CH(OR)- 3.91 (m) 77.2 6² –CH2-OR 3.96 (m); 4.37 (d, J 11.0) 68.0 Rha 1²¢ >CH(OR)(OR¢) 6.40 (br.s) 102.4 C-2² 2²¢ >CH(OH)- 4.85 (m) 72.5 3²¢ >CH(OH)- 4.80 (dd, J 3.0, 9.5) 72.7 4²¢ >CH(OH)- 4.30 (m) 74.1 5²¢ >CH(OR)- 4.95 (m) 70.0 6²¢ –CH3 1.62 (d, J 6.5) 18.3 Rha 1²² >CH(OR)(OR¢) 5.19 (s) 100.6 C-6² 2²² >CH(OH)- 4.27 (m) 72.8 3²² >CH(OH)- 4.26 (m) 72.0 4²² >CH(OH)- 4.07 (m) 73.8 5²² >CH(OR)- 4.01 (m) 69.5 6²² –CH3 1.39 (d, J 5.5) 18.3 Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -28- CBHD: TS. Trần Lê Quan 3.2.4 Hợp chất BM4 Hợp chất BM4 được cô lập dưới dạng bột không màu, tan tốt trong dung môi metanol, sắc ký lớp mỏng pha đảo giải ly bằng hệ dung ly metanol:nước (3:1) cho vết tròn có Rf 0.33, không hấp thu UV, hiện hình bằng acid sulfuric đặc nóng xuất hiện vết tròn màu tím đen. Phổ 1H-NMR của BM4 xuất hiện bảy tín hiệu mũi đơn ứng với bảy nhóm metyl của một triterpen ở dH 0.72 (3H, s, H3-19), 0.90 (3H, s, H3-30), 0.92 (3H, s, H3-18), 1.08 (3H, s, H3-29), 1.16 (3H, s, H3-28), 1.61 (6H, s, H3-26, H3-27), một tín hiệu mũi đơn vùng trường thấp của nối đôi tại dH 5.27 (1H, s, H-24), một mũi đôi đặc trưng cho nhóm metyl của đơn vị đường α-L-rhamnose tại dH 1.59 (3H, d, J 6.0, H3-6″), và bốn tín hiệu proton anomer của bốn đơn vị đường ở dH 4.85 (1H, d, J 5.5, H-1′), dH 5.00 (1H, d, J 7.5, H-1″″), dH 5.06 (1H, d, J 7.5, H-1²¢) và dH 6.10 (1H, s, H-1″). Phổ 13C-NMR, DEPT-90 và DEPT-135 cho tất cả 53 tín hiệu carbon, trong đó có tám carbon metyl, 14 carbon metylen, 25 carbon metin, sáu carbon tứ cấp. Bảy tín hiệu carbon metyl triterpen ở dC 15.6 (C-18), 16.5 (C-19), 16.5 (C-30), 16.7 (C-29), 17.7 (C-27), 25.7 (C-26), 27.9 (C-28), hai tín hiệu carbon vùng trường thấp của nối đôi ở dC 125.9 (C-24), 130.8 (C-25), ba tín hiệu carbon phần aglycon gắn với oxygen ở dC 76.1 (C-21), 76.3 (C-20), 88.1 (C-3) trong đó tín hiệu của carbon C-21 xuất hiện là mũi của một nhóm metylen oxygen hóa. Ngoài ra, còn có tín hiệu của 23 carbon của các đơn vị đường, trong đó có bốn tín hiệu carbon anomer ở dC 101.7 (C-1²), 104.4 (C-1²¢), 104.6 (C-1¢) và 105.8 (C-1²²), cho thấy BM4 Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -29- CBHD: TS. Trần Lê Quan có bốn đơn vị đường. Kết hợp phổ COSY và HSQC, xác định được các vị trí cộng hưởng của proton và carbon của bốn đơn vị đường này, cho thấy BM4 có hai đơn vị đường D-glucopyranose, một đơn vị L-arabinopyranose và một đơn vị L- rhamnopyranose. Phổ HMBC cho thấy các tín hiệu proton của nhóm metyl ở dH 0.90, dH 0.92 cùng cho tương quan với hai carbon tứ cấp, trong khi đó proton ở dH 0.92 và dH 0.72 cùng cho tương quan với carbon metyl dC 50.9 (C-9). Do đó, ba nhóm metyl này lần lượt là H3-30 (dH 0.90), H3-18 (dH 0.92) và H3-19 (dH 0.72) Tín hiệu proton của hai nhóm metyl ở dH 1.08, dH 1.16 cho tương quan HMBC với các tín hiệu carbon của nhau và tương quan với cùng một carbon tứ cấp ở dC 39.7, như vậy các metyl này phải là H3-28 (dH 1.16) và H3-29 (dH 1.08). Tương tự, ta xác định được H3-26 (dH 1.61) và H3-27 (dH 1.61) nhờ tương quan giữa các tín hiệu proton và carbon của nhau và đều tương quan với hai carbon olefin tam cấp C-24 (dC 125.9) và tứ cấp C-25 (dC 130.8). Phổ HMBC cho tương quan giữa proton ở dH 2.16 (1H, m, H-17) với carbon tứ cấp gắn oxygen ở dC 76.3 và carbon metylen gắn oxygen ở dC 76.1 nên hai carbon này lần lượt là C-20 và C-21. Tương quan HMBC giữa proton olefin ở dH 5.32 (1H, m, H-24) và hai carbon metylen ở dC 36.5 và dC 23.3 xác định được hai carbon này lần lượt là C-22 và C-23. Từ tất cả các dữ liệu trên cho thấy BM4 là một triterpen saponin có khung dammaran, là khung triterpen có nhiều trong cây giảo cổ lam.[26] O OH OGlu AraGlu Rha 2 3 20 21 22 23 24 Töông quan HMBC 3 2829 4 19 18 30 17 5 Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -30- CBHD: TS. Trần Lê Quan Phổ HMBC cho tương quan giữa proton anomer ở dH 5.00 (1H, d, J 7.5, H-1²²) của một đơn vị đường D-glucose và carbon metylen oxygen hóa C-21 (dC 76.1), tương quan giữa proton anomer dH 4.85 (1H, d, J 5.5, H-1¢) của đơn vị đường L-arabinose và C-3 (dC 88.1), tương quan giữa proton anomer ở dH 6.10 (1H, s, H-1²) của đơn vị đường L-rhamnose và proton anomer ở dH 5.06 (1H, d, J 7.5, H- 1²′) của đơn vị đường D-glucose còn lại lần lượt với C-2¢ và C-3¢ của đơn vị đường L-arabinose. Như vậy, BM4 có ba đơn vị đường gắn tại vị trí C-3 theo thứ tự như trên và một đơn vị đường D-glucose gắn tại vị trí C-21. Từ tất cả những dữ kiện trên và so sánh với phổ chuẩn, kết luận BM4 chính là (20S)-3b,20,21-trihydroxy-3-O-[a-L-rhamnopyranosyl(1®2)][b-D- glucopyranosyl(1®3)]-a-L-arabinopyranosyldammar-24-en-21-O-b-D- glucopyranosid đã được cô lập lần đầu tiên trong cây cùng chi G. cardiospermum vào năm 2006 [26], nhưng là lần đầu tiên được tìm thấy trong cây giảo cổ lam G. pentaphyllum. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -31-