Luận văn Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẩn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐỖ HOÀNG KHIÊM MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG KHIÊM BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Khóa: 2002-2006 KS. NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS AND DOG SPERM CAPACITATION Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: A.Professor. Dr. TRAN THI DAN DO HOANG KHIEM Veterinarian. QUACH TUYET ANH Term: 2002 - 2006 Engineer. NGUYEN VAN UT Ho Chi Minh City 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Cô Trần Thị Dân đã hết lòng hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, một tấm gƣơng lao động, một phong cách làm việc cần đƣợc noi theo. Thầy Đinh Xuân Phát, cô Quách Tuyết Anh và thầy Nguyễn Văn Út đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm sống và làm việc, tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Thầy Trần Ngọc Hùng đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm về quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Nguyễn Văn Thuận và thầy Nguyễn Thanh Bình đã truyền đạt những kinh nghiệm nghiên cứu thực tế cho tôi. Gia đình Bác Sáu, gia đình chị Hạnh và gia đình anh Phƣớc đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 và những ngƣời bạn thân đã chia sẽ những vui buồn cũng nhƣ hỗ trợ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Thủ Đức, ngày 15-08-06 Đỗ Hoàng Khiêm v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đỗ Hoàng Khiêm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ” Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN 2. BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH 3. KSCNSH. NGUYỄN VĂN ÚT Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến 06/07/06 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Ngày nay, kỹ thuật thụ tinh in vitro ngày càng đƣợc hoàn thiện và có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng nhân giống nhanh ở những thú cao sản hoặc thú quý hiếm. Để tiếp cận kỹ thuật này chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến phản ứng hoạt hóa tinh trùng nhằm hoàn thiện dần các công đoạn trong việc nâng cao tỉ lệ chó quý hiếm đƣợc tạo ra từ kỹ thuật thụ tinh in vitro. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng nhanh hơn với phƣơng pháp vuốt và nuôi cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo. 2. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamelle) cho tỉ lệ thành công 28,6% (tỉ lệ đĩa xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”) trong khi phƣơng pháp không sử dụng lá kính cho kết quả thất bại. 3. Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng. Chất lƣợng của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian bảo quản 0 giờ là tốt nhất, với hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03). vi MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa 1 .................................................................................................................................i Bìa 2 ............................................................................................................................... ii Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ..........................................................................................................iv Mục lục ........................................................................................................................... v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii Danh sách các bảng .................................................................................................... viii Danh sách các hình ........................................................................................................ix PHẦN I. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu ................................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu .................................................................................................................... 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng ....................................................................... 3 2.1.1. Cấu tạo ............................................................................................................ 3 2.1.2. Chức năng ....................................................................................................... 4 2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng ............................................. 4 2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............. 4 2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể .................................... 4 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào .............................................................. 6 2.3.1. Bề mặt chai cấy ............................................................................................... 6 2.3.2. Các đặt tính vật lý ........................................................................................... 6 2.3.2.1. pH .......................................................................................................... 6 2.3.2.2. Dung dịch đệm ...................................................................................... 7 2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu .................................................................................. 7 2.3.2.4. Nhiệt độ ................................................................................................. 7 2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí ........................................................................ 7 2.3.2.6. Độ nhớt ................................................................................................... 8 2.3.3. Tủ cấy .............................................................................................................. 8 2.3.4. Kháng sinh ...................................................................................................... 8 2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào ........................................................................ 8 2.4.1. Nguồn nhiễm ................................................................................................... 8 2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật ...................................................... 8 2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác ....................................................................... 9 2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào ................................................. 9 2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng ............................................................. 10 2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp ............................................................................................. 10 2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp ........................................................................................... 11 2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue .................. 11 2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................... 11 2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi ........ 11 2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó ........................ 12 2.9. Tinh trùng .............................................................................................................. 13 2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng ............................................................ 13 vii 2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng ................................................................................... 14 2.9.3. Đặc tính của tinh trùng .................................................................................. 15 2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong dƣờng sinh dục cái ..................................... 16 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó ................................................ 17 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng .......................................... 17 2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó ............................................... 19 2.11. Hoạt hóa tinh trùng .............................................................................................. 20 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 23 3.1. Nội dung ................................................................................................................ 23 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 23 3.3. Vật liệu .................................................................................................................. 23 3.3.1. Nguồn mẫu .................................................................................................... 23 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 23 3.3.3. Hoá chất ........................................................................................................ 24 3.4. Phƣơng pháp .......................................................................................................... 25 3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................................................. 25 3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ ......................................................... 25 3.4.1.2. Xử lí ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm ............................................ 25 3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ................................................ 26 3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............................................... 28 3.4.1.5. Nhuộm tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng trypan blue ...................... 29 3.4.2. Chuẩn bị tinh trùng cho quá trình thụ tinh in vitro ...................................... 30 3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm ............ 30 3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng ............................................................................... 30 3.5. Xử lí số liệu ........................................................................................................... 34 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 35 4.1. Thí nghiệm 1: thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ........................................ ..35 4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng ................ ..35 4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa ............. 37 4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng.................................................................................. 37 4.3.2. Nồng độ của tinh trùng ................................................................................. 38 4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................................. 39 4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome .......................................... 40 4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng .............................................................. 41 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 44 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 44 5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 45 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 47 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AR: acrosome reaction BOEC: bovine oviductal epithelial cells BSA: bovine serum albumin DNA: deoxyribonucleic acid DNP: deoxyribonucleoprotein ECS: estrous cow serum EGF: epidermal growth factor ELISA: enzyme linked immunosorbent assay ET: embryo stransfer FBS: phosphate buffered saline FCS: fetal calf serum FGF: fibroblast growth factor HSA: human serum albumin IGF: insulin – like growth factor IVC: in vitro culture IVF: in vitro fertilization IVM: in vitro maturation M II: metaphase II PCR: polymerase chain reaction PDGF: platelet – derived growth factor RNA: ribonucleic acid ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị pH......................................................................................................... 7 Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES ...................................................... 9 Bảng 2.3 Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó của Iguer và Verstegen ............... 19 Bảng 2.4 Công thức pha chế 4 môi trƣờng ................................................................... 20 Bảng 4.1 Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy ................. 35 Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng ................................................................... 37 Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng .......................................................................... 38 Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ...................................................... 39 Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome ............... 40 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................ 42 x DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy ................................... 36 Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) ............................... 36 Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa ......................................... 41 Hình 4.4 Tinh trùng đƣợc nhuộm sau phản ứng hoạt hóa ............................................ 41 Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng ........................................................................ 43 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng ................................................................. 37 Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng ................................................................ 38 Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................ 39 Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome ............................ 40 Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................. 42 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình. Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển giải trí của con ngƣời đòi hỏi sâu sắc hơn. Từ đó, chó đƣợc ƣa thích trong nhà phải là chó đẹp, quý, lạ mắt, thƣờng là chó nhập và có giá thành cao. Do đó, tiềm năng của thị trƣờng này ở nƣớc ta còn rất lớn. Tuy nhiên, những loại chó này thƣờng bị giới hạn về mặt sinh sản hay nhân giống. Để giải quyết tốt những vấn đề này, tiềm năng của kĩ thuật thụ tinh in vitro tỏ ra tối ƣu bởi vì kĩ thuật này có những ƣu điểm sau (Hoàng Kim Giao, 2003): - Khai thác đƣợc nhiều nhất tiềm năng sinh sản của con cái, nhất là ở những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cái cao sản. - Góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống và lai tạo giống nhanh để đạt đƣợc những tính trạng mong muốn và năng suất cao. - Đánh giá nhanh khả năng thụ tinh của những con đực giống. - Cung cấp số lƣợng lớn phôi với giá thành hạ cho các nhà nghiên cứu và khai thác tế bào mầm. Hiện nay tỉ lệ phôi thai chó đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi trứng chín in vitro (IVM), thụ tinh in vitro (IVF), nuôi cấy phôi (IVC) và chuyển cấy phôi (ET) vẫn còn khá thấp (Farstad, 2000). Vì vậy, để tiếp cận kĩ thuật thụ tinh in vitro và đáp ứng nhu cầu của xã hội về những giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó” đƣợc thực hiện. 1.2. Mục tiêu Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phôi và hoàn thiện khả năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần tăng khả năng thành công trong thụ tinh in vitro trên loài chó. 2 1.3. Yêu cầu - Thiết lập quy trình nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. - Bố trí thí nghiệm để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tinh pha chế lên khả năng hoạt hóa tinh trùng. 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng 2.1.1. Cấu tạo Ống dẫn trứng đƣợc chia thành 4 đoạn (Trịnh Bình và ctv, 2004): đoạn tiếp giáp sừng tử cung; đoạn eo; đoạn bóng phình to và đoạn loa có hình phễu, mở vào khoang bụng, có những tua ít nhiều chụp lên mặt buồng trứng. Thành ống dẫn trứng, từ trong ra ngoài, gồm ba tầng mô (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004): tầng niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ ngoài. - Tầng niêm mạc gồm biểu mô và lớp đệm. Biểu mô đƣợc cấu tạo bởi bốn loại tế bào: tế bào có lông, tế bào không có lông, tế bào đáy và tế bào trung gian. Tế bào có lông: hình trụ, bào tƣơng sáng, đôi khi có hạt ở vùng chung quanh nhân. Nhân hình trứng, kém bắt màu. Mặt tự do của tế bào có những lông dài cắm vào thể đáy và chuyển động một chiều về phía tử cung. Bào tƣơng chứa ty thể, bộ Golgi, lƣới nội bào và những hạt glycogen. Tế bào không có lông: hình trụ, ít bào tƣơng. Nhân hình cầu hay hình trứng, bắt màu đậm. Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao và những chỗ lõm siêu vi. Bào tƣơng chứa bộ Golgi, ty thể, lƣới nội bào và những hạt chế tiết. Những tế bào không lông là những tế bào chế tiết. Sản phẩm chế tiết của chúng rất cần thiết cho noãn và tinh trùng đã lọt vào trong ống