Luận văn Nghiên cứu bổ sung chitosan oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản Nhật Bản (ipomoea batatas l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI LANG CAO SẢN NHẬT BẢN (IPOMOEA BATATAS L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Buôn Ma Thuột, năm 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN . NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI LANG CAO SẢN NHẬT BẢN (IPOMOEA BATATAS L.) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG Buôn Ma Thuột, năm 2009 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. HỌC VIÊN NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ii LỜI CẢM ƠN! Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn: Người thầy hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. TS. Phan Văn Tân đã tạo điều kiện thuận lợi và chỉ bảo cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn tại bộ môn sinh học thực vật. ThS. Nguyễn Đình Sỹ đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tất cả các thầy cô giáo Khoa Sau đại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học Tây Nguyên. Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị và các bạn đồng nghiệp Trường THCS Đoàn Kết đã luôn tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ cho tôi trong suốt thời gian công tác và học tập. Tất cả các anh, chị và các bạn trong lớp cao học Sinh học thực nghiệm khóa 1 đã luôn động viên và giúp đỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Chị Tuyến, em Ngọc, em Bình ở Bộ môn Sinh học thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên và nhiệt tình giúp đỡ cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Cuối cùng xin gửi lòng biết ơn đến tất cả những người thân trong gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi học tập và làm việc trong suốt thời gian qua.. Xin chân thành cảm ơn! NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN iii MỤC LỤC Trang Các chữ viết tắt ..................................................................................................i Danh mục ảnh ..................................................................................................ii Danh mục bảng ................................................................................................iv Danh mục hình .................................................................................................v MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................3 1.1. Tổng quan về cây khoai lang .........................................................3 1.1.1 Đặc điểm sinh học ....................................................3 1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang ...............7 1.1.3. Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang ........................8 1.1.4Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang ............................9 1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................12 1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................12 1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô .........................14 1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .................15 1.2.4 Các bước nhân giống invitro ..........................................15 1.2.5. Khử trùng mẫu nuôi cấy .................................................15 1.2.6. Mẫu cấy ...........................................................................17 1.2.7. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật ................................18 1.2.8. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ............................19 1.3. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................25 1.4 Sự phát sinh hình thái ..................................................................26 1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam ..........28 iv 1.6. Tổng quan về Chitosan .............................................................29 1.6.1. Công thức cấu tạo ......................................................29 1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitosan .................31 CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........40 2.1. Nội dung nghiên cứu ...................................................................40 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................40 2.2.1. Vật liệu, hóa chất ...........................................................40 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................41 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng đến sức sống của mô nuôi cấy ........................................................41 2.2.2.2. Nghiên cứu thành phần môi trường đến sự hình thành protocorm .................................................................................44 2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ đốt thân khoai lang in vitro ......................................................46 2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ và tăng trưởng chồi cây khoai lang in vitro ....................................................................48 2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô ......................................................................................50 2.2.2.6 Xử lý số liệu thống kê ...............................................52 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................53 3.1. Ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang ........................................................................53 3.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang .............................................. 53 v 3.1.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang ........................................................................... 57 3.1.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang.............................................................................69 3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hình thành protocorm .............................................................................................................62 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ, tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng đến hình thành chồi và rễ cây con trong in vitro .................................................65 3.3.1. Ảnh hưởng của N6 - benzyladenine (BA) và Kinetin ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau đến sự hình thành chồi và tăng trưởng chồi cây khoai lang ......................................................65 3.3.2. Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau đến sự hình thành rễ cây khoai lang ................................69 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô .......................................75 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................81 KẾT LUẬN .................................................................................................81 ĐỀ NGHỊ .....................................................................................................81 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................82 PHỤ LỤC vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Acid abscisic BA N6 – benzyladenine cs cộng sự CV Coefficient of Variation GA3 Gibberellin MS Murashige và Skoog NAA Napthalen acetic acid IAA Idol – 3 – acetic acid IBA Indol – 3 – btyric acid TDZ Thidiazuron JA Jasmonic acid vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy .........................................................................................55 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy .......................................................................59 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy .......................................................................61 Bảng 3.4 . Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hình thành protocorm sau 40 ngày nuôi cấy ............................................................................64 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ đốt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy .....................67 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy ..............................................72 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến sinh trưởng của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy ......................................77 viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin ............................................19 Hình 1.2. Cấu trúc của auxin tự nhiên và auxin tổng hợp ............................19 Hình1. 3. Cấu trúc của một số dạng cytokinin ............................................20 Hình 1.4. Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển đổi GA4 thành các GA khác .......................................................................................................21 Hình 1.5. Cấu trúc của ABA .......................................................................22 Hình 1.6. Cấu trúc của ethylen .....................................................................22 Hình 1.7. Cấu trúc của TDZ .........................................................................23 Hình 1.8. Chitin (có 4-10 nghìn gốc N-acetyl-glucosamine) .......................31 Hình 1.9. Chitosan (có 1-4 nghìn gốc glucosamine) ....................................31 Hình 1.10. Olygoglucosamine (có 2- vài chục gốc glucosamine) ...............31 Hình 1.11. Cơ chế hoạt động của Chitosan ..................................................39 Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở các nồng độ 0.1% (A), 0.3% (B), 0.5% (C) ................................................................................................56 Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ......................................................................................60 Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy .........................................................................................62 Hình 3.4. Số lá của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đổi ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy ........................................68 ix Hình 3.5. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay đổi ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy ..........................68 Hình 3.6. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi IBA và NAA thay đổi ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy .................... 72 Hình 3.7. Số rễ của cây khoai lang khi IBA và NAA thay đổi ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy .............................................73 Hình 3.8. Ảnh hưởng của IBA và NAA lên chiều cao chồi, số rễ và chiều dài rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy ................73 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến chiều cao chồi của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày ....................................................78 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan oligomer đến khối lượng chồi tươi và khối lượng chồi khô của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày. ...............................................................................................................78 1 MỞ ĐẦU Khoai lang (Ipomoea batatas L. (Lam) là cây lương thực quan trọng được trồng ở nhiều nước Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ la tinh. Khoai lang không những chỉ có công dụng làm lương thực cho người, thức ăn cho gia súc mà còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm. Người ta có thể chế biến rượu, cồn, xiro ... từ khoai lang. Tinh bột khoai lang còn dùng trong công nghiệp giấy và hồ sợi. Một số nước trên thế giới dùng khoai lang chế biến axit xitoric, dextrin, lấy tinh bột dùng trong y học. Khoai lang chứa nhiều men amilaza biến tinh bột thành đường mạch nha nên là nguồn nguyên liệu tốt cho công nghiệp sản xuất loại men này. Theo thống kê 2006 của Sở Nông Nghiệp – PTNT Đăk Nông và Đăk Lăk, khoai lang cao sản xuất khẩu đang phát triển mạnh với diện tích ở tỉnh Đăk Nông là 4500 ha, Đăk Lăk là trên 3000 ha. Trong thời kỳ đầu, năng suất khoai lang đạt từ 20-25 tấn/ha, giá bán cho suất khẩu là 5 triệu đồng /tấn, đem lại thu nhập cao cho nông dân. Tuy nhiên, sau 5 năm phát triển năng suất khoai lang suy giảm gần 40-50%, chỉ còn 12-15 tấn/ha, làm giảm thu nhập của người nông dân và sản suất không bền vững cả về kinh tế và môi trường. Chitosan và chitosan oligomer là các chất hoạt hóa một số gen thực vật, bằng cách tác động trên promoter của trên 20 gen hệ thống đề kháng của thực vật để tăng cường tổng hợp enzyme chitanase, β- 1,3-glucanase, RNAse, proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp lignin và kháng sinh thực vật phytoalexin. Chính vì vậy, Chitosan và chitosan oligomer làm tăng sức đề kháng của cây với các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và virus [41]. Chitosan và chitosan oligomer làm tăng khả năng kháng bệnh rỉ sắt (Phakopspora foiae) của đậu tương (N.A. Dung, 2002) [30]. Suwalee (2002) công bố phun chitosan cho ngô với nồng độ 100 ppm có khả năng hạn chế 70% bệnh bạc lá[64]. Ngoài ra còn nhiều công bố khẳng định khả năng kháng 2 nấm bệnh của chitosan đối với thực vật, như kháng nấm pythium, Sclerotium, Fusarium (Hirano, 1996 ; N.A. Dung, 2004, R.D. Park, 2002). Chitosan oligomer còn được coi là nhóm điều hòa sinh trưởng thực vật thế hệ mới [68]. Chitosan oligomer có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng hàm lượng diệp lục, tăng số lượng nốt sần cố định đạm và tăng năng suất của lạc [33]. Chitosan oligomer làm tăng cường độ quang hợp của lúa, lạc trong thủy canh [42]. Chitosan oligomer làm tăng chiều dài rễ, kích thước cây con trong nuôi cấy mô [50]. Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá, không sâu bệnh, giảm tỷ lệ nhiễm trong nuôi cấy mô. Chúng tôi đề suất nghiên cứu đề tài: ‘‘Nghiên cứu bổ sung Chitosan oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.).’’ Mục tiêu của đề tài : • Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang cao sản bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong invitro. • Đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung chitosan oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây khoai lang 1.1.1 Đặc điểm sinh học Vị trí phân loại: Giới (regnum): Plantae Ngành (division): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Solonales Họ(familia): Convolvulaceae Chi (genu): Ipomoea Loài (species): Ipomoea batatas L. Khoai lang trên thế giới chủ yếu được phân bố ở các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Mỹ la tinh. Có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới Châu Mỹ, được con người trồng cách đây khoảng 5000 năm. Nó được phổ biến rất sớm trong khu vực này, bao gồm cả khu vực Cariber, đã được biết tới trước khi có sự thám hiểm của người phương tây tới Polinesia. Ngày nay khoai lang được trồng khắp trong các khu vực nhiệt đới và ôn đới ẩm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của cây. Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, nóng, ẩm, nhiệt độ cao, mưa nhiều, lượng mưa phân bố tương đối đều nên rất thuận lợi cho cây khoai lang sinh trưởng và phát triển, do đó có thể trồng quanh năm. Khoai lang (Ipomoea batatas) là một loài cây nông nghiệp với rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, được gọi là củ khoai lang và nó là một nguồn cung cấp rau củ quan trọng, được sử dụng trong vai trò của cả rau lẫn lương thực. Các lá non và thân non được sử dụng như cũng được sử dụng như 4 một loại rau. Khoai lang có họ hàng xa với khoai tây (Solanum tuberosum) có nguồn gốc Nam Mỹ. Là cây thân thảo dạng dây leo sống lâu năm, có các lá mọc so le hình trái tim hay lá xẻ thùy hình chân vịt, các hoa có tràng hợp và kích thước trung bình. Rễ củ ăn được, hình dạng thuôn dài và thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có màu đỏ, tía, nâu hay trắng, bên trong củ có màu vàng, trắng, cam, hay tím. Khoai lang có khối lượng đường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn. Khoai lang được sử dụng củ và lá để làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần đây đang được nghiên cứu để làm màng phủ sinh học ( bioplastic). Do đặc điểm tính đa dạng của giống khoai lang, hơn nữa trong quá trình trồng trọt do chọn lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo nên đã hình thành nhiều loại hình, nhiều giống khác nhau. Khoai lang không chịu được sương giá, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ trung bình khoảng 24 °C (75 °F). Khoai lang ít khi ra hoa nếu khoảng thời gian ban ngày vượt quá 11 giờ. Chúng được nhân giống chủ yếu bằng các đoạn thân (dây khoai lang) hay rễ hoặc bằng các rễ bất định mọc ra từ các rễ củ trong khi lưu giữ bảo quản. Trong các điều kiện tối ưu với 85-90 % độ ẩm tương đối ở 13-16 °C (55-61 °F), củ khoai lang có thể giữ được trong vòng 6 tháng. Nhiệt độ thấp hoặc cao hơn đều nhanh chóng làm hỏng củ. Khoai lang phát triển tốt trong nhiều điều kiện về đất, nước và phân bón. Nó cũng có rất ít kẻ thù tự nhiên nên thuốc trừ dịch hại là ít khi phải dùng tới. Do nó được nhân giống bằng các đoạn thân nên khoai lang là tương đối dễ trồng. Do thân phát triển nhanh che lấp và kìm hãm sự phát triển của cỏ dại nên việc diệt trừ cỏ cũng tiêu tốn ít thời gian hơn. Trong khu vực nhiệt đới, khoai lang có thể để ở ngoài đồng và thu hoạch khi cần thiết còn tại khu vực ôn đới thì nó thường được thu hoạch trước khi sương giá bắt đầu. Khoai lang 5 có khả năng thích ứng với nhiều loại đất khác nhau, nhưng sinh trưởng tốt nhất trên các loại đất thoáng khí như đất thịt nhẹ và đất pha cát. Thời gian sinh trưởng của cây khoai lang ngắn ngày nhưng lại cho năng suất cao, do đó cần phải bón nhiều phân và đủ dạng cần thiết. Vì vậy, nói chung điều kiện khí hậu, thời tiết ở nước ta cho phép trồng khoai lang quanh năm, nhưng cũng cần lưu ý tới những đặc điểm riêng của từng vùng khí hậu khác nhau để bố trí thời vụ cho thích hợp. 6 Ảnh 1.1. Cánh đồng trồng khoai lang Ảnh 1.2. Củ khoai lang cao sản Nhật Bản (Benniazuma) 7 1.1.2 Tình hình nghiên cứu