Luận văn Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme glucoamylase trong quy trình sản xuất rượu nếp

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG VÕ PHAN HẢI ÂU NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU NẾP Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2009 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG VÕ PHAN HẢI ÂU Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU NẾP Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Ts. NGUYỄN CÔNG HÀ VÕ PHAN HẢI ÂU MSSV: 2051615 Lớp: CNTP K31 Cần Thơ, 2009 i LỜI CẢM TẠ Xin thể hiện lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn Nguyễn Công Hà đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành biết ơn Tất cả Quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm bổ ích để hoàn thành đề tài luận văn cũng như trang bị cho tôi những kinh nghiệm để bước vào đời. Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Xin cảm ơn Tập thể lớp Công nghệ thực phẩm khóa 31 đã giúp đỡ, động viên, góp ý chân thành giúp bài luận văn của tôi được hoàn thiện hơn. Bạn bè của tôi tại Tp Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại đây. Kính dâng cha mẹ đã nuôi con khôn lớn Sinh viên thực hiện Võ Phan Hải Âu ii TÓM LƯỢC Đề tài thực hiện nhằm mục tiêu tiếp nối nghiên cứu của Võ Văn Tuấn nhằm tối ưu hóa quá trình thủy phân dịch nếp có sử dụng chế phẩm enzyme amylase. Trên cơ sở những kết quả đã đạt được từ đề tài nghiên cứu “Ứng dụng enzyme α- amylase và glucoamylase và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp”, trong đề tài này chúng tôi tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố cần thiết cho quá trình đường hóa nguyên liệu nếp trắng có sử dụng kết hợp chế phẩm enzyme α- amylase và glucoamylase. Kết quả thu được như sau: Đối với quá trình đường hóa sử dụng kết hợp enzyme α-amylase và glucoamylase: nồng độ enzyme glucoamylase thích hợp nhất là 0,4%, nhiệt độ thích hợp cho quá trình xử lý enzme glucoamylase là 600C, pH xử lý là 4,0 tương ứng với thời gian sử dụng glucoamylase thích hợp cho hiệu quả kinh tế cao là 30 phút. iii MỤC LỤC CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1 1.1 Đặt vấn đề ..............................................................................................................1 1.2 Mục tiêu đề tài ......................................................................................................1 1.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về gạo nếp ...........................................................................................3 2.2 Enzyme amylase ...................................................................................................3 2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme amylase .........................................................3 2.2.2 Thành phần hệ enzyme amylase.................................................................4 2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của các loại amylase ......................................5 2.2.4 Hoạt lực của enzyme amylase ..................................................................11 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase.......................12 2.3 Nấm men ..............................................................................................................16 2.3.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men .......................................................16 2.3.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men...............................................17 2.3.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang ...........................................17 2.4 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp......................................19 2.4.1 Quá trình hồ hóa tinh bột nếp..................................................................19 2.4.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu nếp .........................................20 2.4.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp .....................................21 2.5 Quy trình sản xuất .............................................................................................23 2.5.1 Sơ đồ quy trình .......................................................................................23 2.5.2 Thuyết minh quy trình.............................................................................24 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 26 3.1 Phương tiện thí nghiệm .....................................................................................26 3.1.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................26 3.1.2 Nguyên liệu .............................................................................................26 3.1.3 Dụng cụ trang thiết bị ..............................................................................26 3.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................26 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu..............................................................................26 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................27 3.3 Bố trí thí nghiệm.................................................................................................27 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng ..........................................................27 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng. .........................................................29 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng. ..............................................................31 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng. ..............................................................35 iv CHƯƠNG 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................39 5.1 Kết luận................................................................................................................39 5.2 Đề nghị .................................................................................................................39 5.3 Quy trình thủy phân tinh bột đề nghị ..............................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................41 v DANH SÁCH BẢNG, HÌNH Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp.............................................................3 Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................6 Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................6 Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men ..............................................16 Bảng 4.1 Hàm lượng đường khử theo pH và nồng độ enzyme glucoamylase.......32 Bảng 4.2 Hàm lượng đường khử khi đường hóa bằng enzyme glucoamylase ở các mức nồng độ enzyme và nhiệt độ khác nhau. .......................................................35 Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase .........................................4 Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của amylase lên phân tử tinh bột....................................5 Hình 2.4 Tác dụng của β-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin ..............9 Hình 2.5 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột.........................................10 Hình 2.6 Tổng quát hóa quá trình thủy phân tinh bột của amylase........................11 Hình 2.7 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men ........................17 Hình 4.1 đồ thị biểu hiện sự thay đổi hàm lượng đường khử theo pH và nồng độ enzyme.................................................................................................................32 Hình 4.2 Đồ thị mối quan hệ giữa hàm lượng đường khử với pH và nồng độ enzyme.................................................................................................................33 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase xử lý.............................................................................36 Hình 4.4 Đồ thị mối quan hệ giữa hàm lượng đường khử với nhiệt độ và nồng độ enzyme……………………………………………………………………………37 1 CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Rượu vang là một thức uống có độ cồn thấp, có hương vị đặc trưng của từng loại nguyên liệu tạo thành, điều đặc biệt là rượu vang có độ cồn thấp, chỉ vào khoảng từ 11% cho đến 14%, so với rượu mạnh là từ 40% cho đến 45%. Vì vậy nếu sử dụng rượu này một cách điều độ, vừa phải thì rất có lợi cho sức khỏe. Ở điều kiện nước ta, ngoài các loại rượu vang được sản xuất bằng phương pháp lên men dịch nước ép trái cây như nho, khóm,…các nhà sản xuất còn áp dụng trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau, chẳng hạn gạo nếp than, gạo nếp trắng,… nhờ đó sản phẩm rượu vang ở nước ta ngày càng đa dạng, phong phú. Trong đó sản phẩm rượu từ gạo nếp trắng vừa cho sản phẩm có hương thơm đặc trưng vừa là nguyên liệu được trồng phổ biến ở nước ta nên có giá thành tương đối rẻ rất thích hợp cho việc đi sâu nghiên cứu cho sản phẩm này. Ngày nay, với việc ứng dụng phương pháp enzyme và nấm men thuần chủng ở giai đoạn đường hoá và lên men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như đảm bảo chất lượng rượu vang thành phẩm sẽ giảm chi phí sản xuất, đảm bảo chất lượng và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm này. 1.2 Mục tiêu đề tài Như đã biết trong công nghệ sản xuất rượu nếp, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu suất thu hồi rượu thành phẩm như các yếu tố tối ưu cho hoạt động của enzyme sử dụng, loại và chất lượng nguyên liệu, loại nấm men sử dụng… Trên cơ sở kế thừa những thành quả đã đạt được từ đề tài nghiên cứu của Võ Văn Tuấn, chúng tôi tiếp tục thực hiện để tìm ra các yếu tố tối ưu cho quá trình đường hóa có sử dụng kết hợp enzyme α-amylase và glucoamylase. Vì vậy, đề tài này tập trung nghiên cứu hướng đến những mục tiêu chính sau: Tìm ra pH, nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme glucoamylase cho quá trình đường hóa. Tìm ra nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thích hợp cho quá trình đường hóa. Bổ sung kết quả đạt được vào quy trình sản xuất để thu được sản phẩm rượu có chất lượng cao góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho sản phẩm. 1.3 Nội dung nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra trong quá trình đường hóa. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra trong quá trình đường hóa. 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về gạo nếp Nguồn gốc Gạo nếp là loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở vùng Nam Bộ. Hạt gạo này có màu đục và có mùi thơm đặc trưng. Thành phần hóa học Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14 Protein 8,2 Lipid 1,5 Glucid 74,9 Acid hữu cơ 0,6 Tro 0,8 (Nguyễn Đức Lượng, 2003) 2.2 Enzyme amylase 2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme amylase Nguồn enzyme amylase từ vi sinh vật Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase do chúng có khả năng tích trữ một lượng lớn enzme này trong những điều kiện xác định. Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các loại amylase. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau và thậm chí các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzyme khác nhau. Có nhiều nguồn thu enzyme amylase như các giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus…. Nhiều loại thuộc giống này như Asp. Oryzae, Asp. Niger,…(Nguyễn Đức Lượng, 2006) 3 2.2.2 Thành phần hệ enzyme amylase Dựa theo tính chất và cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột. người ta xếp enzyme amylase thành hai nhóm là endoamylase (enzyme nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân). Chúng gồm sáu loại: Endoamylase (enzyme nội phân) gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh được chia thành hai loại, khử trực tiếp là pullulanase (α- dextrin-6-glucanohydrolase), khử gián tiếp là tranglucosidase và amylase-1,6- glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết trong chuỗi polysaccharide. Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm β-amylase và glucoamylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase (Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2003) Amylase Khử gián tiếp là tranglucosidase và amylase-1,6-glucosidase) Khử trực tiếp là pullulanase (α- dextrin-6-glucanohydrolase) β-amylase Endoamylase Exoamylase Glucoamylase Enzyme khử nhánh α-amylase 4 2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của các loại amylase Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của amylase lên phân tử tinh bột 2.2.3.1 α-amylase Đặc tính Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính acid yếu. Protein của α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau. Enzyme α-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionine, có khoảng 7 ÷ 10 gốc cysteine. Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase. Đồng thời, nó còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein. Nếu enzyme α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó hoàn toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất. Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion đơn hóa trị như Cl- > Br- > I-. Chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+. Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. Điều kiện hoạt động và độ bền của các enzyme α-amylase từ các nguồn gốc khác nhau thì không giống nhau. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) 5 Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau Nguồn gốc Ph tối thích Nhiệt độ tối thích Malt 5,5 ÷ 5,7 72 ÷ 75 Vi khuẩn 5,0 ÷ 6,0 50 ÷ 60 Nấm mốc 6,0 ÷ 7,0 60 ÷ 70 (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau Hoạt tính (% so với hoạt tính ban đầu) Nhiệt độ Malt Nấm mốc Vi khuẩn 65 100 100 100 70 100 52 100 75 58 3 100 80 25 - 92 85 1 - 58 90 - - 52 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó, enzyme này được gọi là enzyme nội phân (endo enzyme). Enzyme α-amylase không những có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân cắt thành oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6 ÷ 7 gốc glucose), sau đó các oligosaccharide lại tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi ngắn hơn và tạo thành maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylase là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose và 19% glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và 6 isomaltose (8%) do α-amylase không cắt được liên kết 1,6-glycoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase + Giai đoạn dextrin hóa: chỉ một số cơ chất bị thuỷ phân nhánh tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh. + Giai đoạn đường hóa: các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thuỷ phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose. Các chất này bị thuỷ phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosacharide. Dưới tác dụng của α- amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6 ÷ 7 gốc glucose. Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm các maltotetrose, maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷ phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Dextrin phân tử lương thấp Tinh bột α-Amylase Di và monosaccharide Dextrin Tetra và trimaltose Amylose Oligosaccharide Polyglucose Maltotetrose Maltotriose Maltose α-Amylase Hình 2.3 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin α-Amylase 7 2.2.3.2 β-amylase Đặc tính Enzyme β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó chứa gốc –SH, - COOH, cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. Enzyme β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nẩy mầm. Trong vi khuẩn không có β- amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc vẫn chưa xác định. Enzyme β-amylase rất bền khi không có Ca2+, bị kìm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, acetanic, iod, ozon. pH tối thích trong dịch bột thuần khiết là 4 ÷ 6, trong dung dịch nấu là 5 ÷ 5,6. Nhiệt độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40 ÷ 500C, trong dung dịch nấu là 60 ÷ 650C. Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 700C. Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin Enzyme β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glycoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại. Phân cắt tuần tự gốc maltose một ở đầu không khử. Maltose có cấu hình β được tạo thành, β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exoenzyme). Enzyme β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Phân giải 54 ÷ 58% amylopectin thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có 20 ÷ 25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo 10 ÷ 12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α-1,4 glycoside gắn với α-1,6 glycoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn. Các dextrin này có chứa nhiều liên kết α-1,6 glycoside bắt màu đỏ tím với iod. 8 Tinh bột Maltose (54 ÷ 58%) + Dextrin (42 ÷ 46%) Nếu sử dụng đồng thời α-amylase và β-amylase thì có thể thủy phân đến 5% tinh bột. Hình 2.4 Tác dụng của β-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin 2.2.3.3 γ-amylase (glucoamylase) Đặc tính Enzyme γ-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột mà không cần có sự tham gia của các enzyme amylase khác. Nó thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với polysacchacaride có phân tử nhỏ. So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone, không bền với ion kim loại nặng Cu2+,Hg2+. Enzyme này có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn . Enzyme này hoạt động tốt ở 500C. Hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose, là enzyme ngoại ph