Luận văn Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN LÊ PHƯƠNG HÀ TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Buôn Ma Thuột, năm 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN . LÊ PHƯƠNG HÀ TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG Buôn Ma Thuột, năm 2009 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Họ tên tác giả Lê Phương Hà ii LỜI CẢM ƠN ! Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Tây Nguyên. Các thầy cô Khoa sau Đại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học Tây Nguyên. Các thầy cô phòng thí nghiệm Sinh học thực vật – Khoa Nông Lâm Nghiệp Trường Đại học Tây nguyên đã động viên và giúp đỡ cho tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị, các bạn đồng nghiệp và đặc biệt là Khoa Trồng Trọt trường Cao đẳng Công Nghệ và Kinh Tế Bảo Lộc đã luôn tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian công tác và học tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dạy và giúp đỡ trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Xin ghi nhận sự giúp đỡ của các anh chị trong lớp Cao học Sinh Học Thực Nghiệm K1 đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn sự quan tâm , khích lệ của người thân trong gia đình đã luôn luôn động viên về mọi mặt để tôi hoàn thành tốt khóa học này. Xin chân thành cảm ơn! LÊ PHƯƠNG HÀ iii MỤC LỤC Trang Các chữ viết tắti Danh mục ảnh.............ii Danh mục bảng..iv Danh mục hìnhv MỞ ĐẦU.............1 Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......3 1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer...3 1.1.1. Công thức cấu tạo .3 1.1.2. Tính chất của chitosan ..4 1.1.3. Các đặc tính của chitosan .....................................................................6 1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn suất ...7 1.1.5. Tình hình nghiên cứu cải biến chitosan ..............................................15 1.1.6. Các dẫn suất cải biến của Chitosan ....................................................20 1.1.6.1. Chitooligosaccharide ....20 1.1.6.2. Các dẫn suất của Chitosan ....21 1.1.7. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan và dẫn suất ..............................25 1.2. Tình hình bảo quản thực phẩm hiện nay ...............................................26 1.3. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ..........................................27 1.3.1. Vi khuẩn Escherichia coli ..................................................................27 1.3.1.1. Đặc điểm chung ...............................................................................27 1.3.1.2. Đặc điểm sinh vật ............................................................................28 1.3.1.3. Phòng và trị .....................................................................................28 1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................28 iv 1.3.2.1. Đặc điểm chung ...............................................................................28 1.3.2.2. Phòng bệnh và chữa bệnh ................................................................29 Phần 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................30 2.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................30 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................30 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ..........................................................................30 2.2.2. Vật liệu hoá chất.................................................................................30 2.2.3. Thiết kế thí nghiệm.............................................................................30 2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ......................................................30 2.2.4. Các bước tiến hành .............................................................................31 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan ........................................32 2.2.5.1. Phương pháp cải biến chitosan-glucose ..........................................32 2.2.5.2. Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine ..................................33 2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến ...........................................................................................33 2.2.6.1. Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục....33 2.2.6.2. Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa .................................................................................................................34 2.2.7. Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm ............................................................................................34 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................37 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................38 3.1. Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến ....................................38 3.1.1. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng độ chitosan/glucose đến phản ứng Maillard .....................................................38 3.1.2. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng độ đường glucose đến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan..........40 v 3.2. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến trong invitro...................................................................................................41 3.2.1. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan – glucose ...............41 3.2.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn chitosan – glucosamine cải biến .........................................................................................................52 3.3. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan cải biến bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa ...............................................................62 3.3.1. Đối với chitosan – glucose .................................................................62 3.3.2. Đối với chitosan – glucosamine ........ ................................................65 3.4. Nghiên cứu thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm .....................................................................................................67 3.4.1. Đối với chitosan – glucose .................................................................67 3.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucose đến trạng thái cảm quan của thịt trong quá trình bảo quản ..................................................................67 3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucosamine đến trạng thái cảm quan của thịt trong quá trình bảo quản .........................................................71 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................76 4.1. Kết luận .76 4.2. Đề nghị ..76 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................77 Tiếng Việt .....................................................................................................77 Tiếng Anh .....79 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CGC Chitosan – glucose CT1 Công thức 1 CT2 Công thức 2 CT3 Công thức 3 ĐC Đối chứng TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam CV Coefficient of Variation Da Daton ppm parts per million CGC chitosan - glucose LMWC khối lượng phân tử thấp PEG polyethylene glycol vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng1.1: . Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan đến khả năng kháng khuẩn..17 Bảng 1.2: Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC....18 Bảng 2.1: Cơ sở cho điểm thịt bò theo TCVN 3215-79...37 Bảng 2.2: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của thịt....38 Bảng 2.3: Bảng phân cấp chất lượng thịt. 38 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng độ đường glucose đến mức độ phản ứng Maillard....40 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng độ đường glucosamine đến mức độ phản ứng Maillard41 Bảng 3.3: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 30000 Da đối với vi khuẩn Escherichia coli.................43 Bảng 3.4: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 30000 Da đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus..45 Bảng 3.5: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 300000 Da đối với vi khuẩn Escherichia coli...46 Bảng 3.6: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 300000 Da đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus....48 Bảng 3.7: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 700000 Da đối với vi khuẩn Escherichia coli...50 Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân tử 700000 Da đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus....51 Bảng 3.9: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 30000 Da đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus.53 viii Bảng 3.10: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 30000 Da đối với vi khuẩn Escherichia coli....55 Bảng 3.11: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 300000 Da đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus...56 Bảng 3.12: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 300000 Da đối với vi khuẩn Escherichia coli..57 Bảng 3.13: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 700000 Da đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus...59 Bảng 3.14: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử 700000 Da đối với vi khuẩn Escherichia coli..60 Bảng 3.15: Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa đối với vi khuẩn S. aureus..62 Bảng 3.16: Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa đối với vi khuẩn Escherichia coli.63 Bảng 3.17: Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus......64 Bảng 3.18: Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa đối với vi khuẩn Escherichia coli.65 ix DANH MỤC HÌNH VẼ, CÁC ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose...3 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) đến trạng thái cảm quan của thịt...67 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) đến trạng thái cảm quan của thịt...67 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) đến trạng thái cảm quan của thịt...68 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt độ lạnh (50C) đến trạng thái cảm quan của thịt...69 Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt độ lạnh (50C) đến trạng thái cảm quan của thịt...69 Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt độ lạnh (50C) đến trạng thái cảm quan của thịt...70 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) đến trạng thái cảm quan của thịt...71 x Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) đến trạng thái cảm quan của thịt71 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) đến trạng thái cảm quan của thịt72 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt độ lạnh (50C) đến trạng thái cảm quan của thịt..72 Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt độ lạnh (50C) đến trạng thái cảm quan của thịt..73 Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt độ lạnh (50C) đến trạng thái cảm quan của thịt..73 ĐẶT VẤN ĐỀ Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những mối quan tâm chung của toàn xã hội và là vấn đề thời sự được dư luận quan tâm, nhất là khi các cơ quan chức năng mới phát hiện hàng loạt những vi phạm nghiêm trọng về vệ sinh an toàn thực phẩm. Khi xu hướng sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn của thị trường đang gia tăng, đặc biệt là đối với các sản phẩm thịt chế biến cổ truyền của Việt Nam như giò lụa, nem chua, lạp xưởng, xúc xích được người tiêu dùng ngày càng ưa chuộng. Tuy nhiên, theo báo cáo của Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Minh (1999) cho thấy 50-60% mẫu xét nghiệm không đạt tiêu chuẩn vi sinh và sinh hóa. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn và độc tố của nó thường xảy ra do thiếu sót trong quá trình chế biến, công tác kiểm tra, thanh tra thực phẩm và nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm. Loại ngộ độc này thường do Salmonella enteritidis, Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,.. Hiện nay, để bảo quản các loại thực phẩm tươi như thịt, cá, giò chả phần lớn người ta đã sử dụng các chất hóa học như phân urê, hàn the, benzoate natri, trong nước mắm có urê hay sử dụng formon trong làm bánh phở, hàn the để làm chả nem, hầu hết các chất này khi vào cơ thể tích tụ lâu ngày sẽ gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và nghiêm trọng hơn nữa là gây ra các bệnh ung thư và làm giảm giá trị của thực phẩm. Chitosan là một polimer sinh học, được tách từ vỏ tôm, cua, côn trùng, giáp xác và tế bào nấm. Chitosan là một poly-glucosamin được cấu tạo từ các gốc glucosamin kiên kết với nhau bằng liên kết β - 1,4 glucoside. Chitosan và các sản phẩm thủy phân của chitosan là chitosan oligomer là các sản phẩm của tự nhiên, không độc, không gây ô nhiểm môi trường nhưng có hoạt tính sinh học rất cao. Chitosan được chứng minh là một chất có hoạt tính kháng khuẩn, chống nấm và chống oxi hóa nhờ tính chất polycation tự nhiên nên có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, enzyme của 2 một số vi khuẩn tiết ra có khả năng phân hủy và làm mất hoạt tính của chitosan. Vì vậy, để tăng cường hoạt tính kháng khuẩn, hạn chế khả năng phân huỷ của enzyme do vi sinh vật tiết ra, cần phải cải biến thay đổi cấu trúc của chitosan. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”. Mục tiêu của đề tài là: 1. Cải biến chitosan nhằm nâng cao hoạt tính kháng khuẩn. 2. Thử nghiệm ứng dụng chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm. 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer 1.1.1. Công thức cấu tạo Chitosan là một polymer sinh học với các đơn phân N-acetyl glucosamine được deacetyl hoá một phần, hiện diện tự nhiên trong vách một số giống nấm như Mucorales (Muzarelli, 1993)[42]. Tuy nhiên, phần lớn lượng chitosan hiện đang được thu nhận và sử dụng lại chủ yếu từ quá trình deacetyl hoá chitin, thành phần chính của trong bộ xương ngoài của động vật giáp xác như tôm, cua hay mực. Chitosan dễ tan trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic. Khi phân hủy chitosan bằng các tác nhân khác nhau như axít clohidric, enzyme chitosanase, cellulase hoặc bức xạ gamma sẽ tạo nên các sản phẩm có chiều dài mạch ngắn hơn gọi là oligoglucosamine. Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose. 4 Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(số 2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết b-(1-4-glicoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly b-(1,4)-2-amino-2-deoxi-D-glucose hoặc là poly b- (1-4)-D-glucosamine (cấu trúc bậc III). Các đơn vị cấu tạo nên phân tử chitosan là -D-glucosamine hay -(1,4)- 2-amino-2-deoxy-D-glucose. 1.1.2. Tính chất của chitosan a. Tính chất vật lý Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị, hòa tan dễ dàng trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic. Ngay từ năm 1968, K.Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không có tính độc, không gây độc trên động vật thực nghiệm và người. Nhiều tác giả chỉ rõ chitosan, chitosan glucosamine có nhiều ưu điểm: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, hòa hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật. b. Tính chất hóa học Phân tử lượng từ 10 -1000 kDa tùy theo điều kiện sản xuất. Mức độ deacetyl hoá thường từ 70% đến 100%. Nhiệt độ nóng chảy từ 309oC đến 311oC tùy theo trọng lượng phân tử và mức độ deacetyl hoá. Chitosan tan trong dung dịch loãng các axít hữu cơ như axít acetic, axít formic, axít adipic, axít propionic và một số axít vô cơ. Ba thuộc tính cơ bản nhất của chitosan là: phân tử lượng, mức độ deacetyl hoá và độ tinh sạch. Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích axetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH2 trong 5 mắt xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là amit. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N-. Mặt khác chitosan là những polimer và các monomer được nối với nhau bởi các liên kết b-(1,4)-glicoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzime thủy phân. * Các phản ứng của nhóm –OH Phản ứng của nhóm –OH có thể tạo ra các dẫn suất. - Dẫn xuất sunfat. - Dẫn xuất O-axyl của chitin/chitosan. - Dẫn xuất O-tosyl hóa chitin/ chitoan. * Phản ứng ở vị trí N. - Phản ứng N-acetyl hóa chitosan. - Dẫn xuất N-sunfat chitosan. - Dẫn xuất N-glycochitosan(N-hydroxyl-etylchitosan). - Dẫn xuất acroleylen chitosan. * Các phản ứng xảy ra tại vị trí O, N. -Dẫn xuất O,N-cacboxymetylchitosan. -Dẫn xuất N,O-cacboxymetylchitosan. - Phản ứng cắt đứt liên kết b-(1,4) glycoside. c. Các phương pháp thu nhận chitosan oligomer Để thu nhận chitosan oligomer từ chitosan hiện nay có 3 phương pháp chủ yếu: - Phương pháp hóa học Đây là phương pháp khá đơn giản, sử dụng các axít clohidric (6-12N) để thủy phân, nhiệt độ thủy phân từ 80-1000C Domard,(1989). Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là chi phí dành cho thiết bị cao, phải có thiết bị chống ăn mòn axít, gây ô nhiễm môi trường và nhất là hiệu suất thu 6 hồi các phân đoạn oligoglucosamine có hoạt tính thấp, sản phẩm là các monomer là glucosamine cao (>30%). - Phương pháp phân hủy bằng bức xạ gamma Bức xạ gamma tăng cường độ deacetyl hóa và giảm bớt trọng lượng phân tử củ