Luận văn Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh Protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------------------- NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH Hà Nội, 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi học tập và hoàn thành luận văn của mình. Hà Nội, ngày thángnăm 2012 Học viên Nguyễn Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis ......................................................... 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis ..................................... 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt........................................................................... 6 1.1.3. Đặc điểm sinh hoá ....................................................................................... 8 1.1.4. Đặc điểm phân loại ..................................................................................... 8 1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ........................ 9 1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis ............................................... 11 1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể ..................................................... 13 1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng ................................. 14 1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam ................................................... 15 1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc .......... 16 1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai ............. 18 1.2. Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy ..................................................... 19 1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy .............................................................................. 19 1.2.2. Côn trùng thử nghiệm ............................................................................... 19 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24 2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 24 2.1.1. Sinh phẩm .................................................................................................. 24 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 26 2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh ................................ 26 2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt ........................................................................ 27 2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm .................................................. 27 2.2.4 Tách chiết DNA plasmid ............................................................................ 28 2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR ...................................... 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 30 2.2.7 Xác định trình tự nucleotide ...................................................................... 32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 33 3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ ................................................... 33 3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu ..................... 33 3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh .................................................................. 35 3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu ............. 36 Nồng độ bào tử .................................................................................................... 36 Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ .................................. 37 3.2 Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C ........................................... 39 3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR............................. 39 3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 40 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C ........................................................... 44 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 Amp Ampicillin 2 Bp Base pair 3 Bt Bacillus thuringiensis 4 Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai 5 dH2O Nước khử ion 6 DNA Deoxyribonucleotide acid 7 E. coli Escherichia coli 8 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid 9 OD Optical density 10 PCR Polymerase chain reaction 11 SDS Sodium dodecyl sulphate 12 Sol Solution 13 TE Tris EDTA 14 X-gal 5- Bromo- 4 Chloro- 3 indolyl β- D- galactoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt .............. 10 Bảng 3.1. Sự đa dạng hình thái tinh thể của các chủng Bt........ ................................. 34 Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm . 37 Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm. ................... 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của B. thuringiensis ... ................... 7 Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis ....................................... .................... 8 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac ................14 Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B. thuringiensis .. .................. 15 Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ .... ........... 21 Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại ... ............... 21 Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng .... ........... 23 Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC...........33 Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần . ............................ 34 Hình 3.3. Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần.... ................... 36 Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu.. ........................... 37 Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu... .......... 38 Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu .................... 39 Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua đêm. ....... 41 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13 ........... 42 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên agarose 1%.......................................................................................................... .......... 43 Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp.44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên 180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà. Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Trung bình mỗi hectar cây trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan các loại hóa chất diệt côn trùng đã để lại dư lượng thuốc trong nông phẩm, gây độc hại đối với sức khỏe người sử dụng và gây ô nhiễm môi trường. Thay vào các biện pháp hóa học thì các biện pháp sinh học được khuyến khích sử dụng. Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm hơn 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới và hoàn toàn không độc với con người, động vật và môi trường [24]. Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) được nghiên cứu nhiều nhất trong 82 dưới loài của Bacillus thuringiensis. Bacillus thurigiensis subsp. aizawai có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptera), trong đó có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) và một số côn trùng bộ 2 cánh (Diptera). Cry1C là một loại protein thể độc do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ cánh vảy rất mạnh. Vì vậy, để có thể sản xuất được thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng cánh vảy hoặc chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng bộ cánh vảy vào cây trồng, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.1. Mục tiêu - Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy. - Tách dòng và đọc trình tự được gene cry1C của các chủng Bta đã sàng lọc có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy. 1.2. Nội dung - Thu thập các chủng B. thuringiensis phân lập tại một số địa điểm ở Thái Nguyên. - Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương pháp huyết thanh học. - Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được. - Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR. - Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy. - Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình tự gene trên Gene Bank. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis  Trên thế giới B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8]. Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8]. Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục thân ở Châu Âu. Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mì tại Pháp. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất là protein [8]. Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với khối lượng lớn từ chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki. Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [33]. Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh. Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt var. israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera) [14]. Năm 1981, Schnepf và Whiteley lần đầu tiên đã phân lập và tách dòng gene độc tố mã hóa diệt sâu của chủng Bt subsp. kurstaki HD-1 gọi là gene cry1 và cho biểu hiện gene này ở E. coli. Từ đó một số lượng lớn các gene đã được tách dòng và nghiên cứu đặc tính. Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự phát hiện ra dưới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera). Chủng này được phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar. Sau đó, công ty Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự Bt subsp. morrisoni đặt tên là Bt subsp. Sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gene độc tố của chúng [14]. Năm 1985, gene cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm 1995 các cây chuyển gene đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng. Từ năm 1987 -1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao [10, 13, 25]. Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp – cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gene [2]. Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có khả năng diệt tế bào ung thư. Năm 2005, Ohba và N.D. Binh đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung ở người [10,13]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao.  Ở Việt Nam Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác giả như Nguyễn Công Bình , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu tiên mở đường nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam [10]. Thời kỳ mở đầu nghiên cứu Các công bố khoa học về nghiên cứu B. thuringiensis ở thời kỳ này còn rất ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B. thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, B. thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm B. thuringiensis này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [8,10]. Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994) Ở thời kỳ này, các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm B. thuringiensis theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [10]. Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay) Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm B. thuringiensis kém chất lượng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng B. thuringiensis bước vào thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên học đã chuyển việc nghiên cứu B. thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng B. thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gene B. thuringiensis phục vụ sản xuất [10]. Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [6]. Năm 2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gene của Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được 22 dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [7, 11]. Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng [5,12]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. [9,13]. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen. Năm 2005, gene kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [14]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng. Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que, kích thước 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào [26,27,28]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc dạng trơn nhẵn. Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng. Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thước 1,6-2m. Bào tử được hình thành trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27]. Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21] Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp. Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu). Tinh thể có