Luận văn Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene

HOÀNG THỊ THÚY NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHO CHUYỂN GENE Luận văn Thạc sĩ sinh học Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Xuân Đắc Hà Nội, 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 NỘI DUNG BÁO CÁO 1. Mở đầu 2. Vật liệu và phương pháp 3. Kết quả nghiên cứu 4. Kết luận và đề nghị 1. Më §ÇU * Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek là cây họ đậu ngắn ngày có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao. Tuy nhiên, năng suất đậu xanh của nước ta còn thấp, do bộ giống đậu xanh còn nghèo nàn. * Chính vì vậy những nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi, thời gian chín tập trung… là những vấn đề có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng. * Hiện nay, một trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn tạo giống đậu xanh là sử dụng các kĩ thuật sinh học hiện đại để tạo ra giống đậu xanh mới có nhiều ưu việt. * Trên cơ sở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đề tài:“Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene”.  2. Mục đích nghiên cứu - Xây dựng hệ thống tái sinh cây đậu xanh phục vụ cho chuyển gene. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt đậu xanh. - Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh thông qua mô sẹo. - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (KTST) tới khả năng tạo đa chồi từ nốt lá mầm, chồi ngọn, đốt thân, khả năng kéo dài chồi. - Xác định ảnh hưởng của IBA và NAA tới khả năng ra rễ của chồi đậu xanh. - Xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng phát triển của đậu xanh nuôi cấy mô trong giai đoạn vườn ươm. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Hai giống đậu xanh ĐX11 và V123 - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 6. Giả thuyết khoa học Xây dựng được quy trình nuôi cấy in vitro cây đậu xanh phục vụ chuyển gene và những nghiên cứu khác. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu - 2 giống đậu xanh ĐX11 và V123 do Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật thuộc Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. - Nghiên cứu này được tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại Thực nghiệm sinh học, thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Thời gian thực hiện: từ tháng 7/2009 - 9/2010.  2.2. Phương pháp. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2.1. Môi trường tạo mô sẹo H1-H11: MS+2,4D (1-11mg/l). 2.2.2 Môi trường tái sinh mô sẹo - BAP: MS +1- 4mg/l - Kinetin: MS + 0,5 - 4mg/l. - TDZ: MS + 0,5mg/l - 4mg/l. - BAP: MS + 1 - 2mg/l kết hợp TDZ 0,5 - 4mg/l. 2.2.3. Môi trường tạo đa chồi T1-T9: MS + (BAP (1-3mg/l) hoặc BAP (1-3mg/l và 10% nước dừa) hoặc Kin (1-3mg/l). 2.2.4. Môi trường kéo dài chồi K1- K5: MS + GA3(0,5-3 mg/l) 2.2.5. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh R1- R6: MS + ( IBA (0,1-0,3 mg/l) hoặc NAA (0,1 – 0,3mg/l). + Nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml. + Áng sáng đèn neon có cường độ 2.500lux. + Thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày. + Nhiệt độ phòng nuôi cấy 27±20 C. Hoặc nuôi trong buồng tối. 2.2.6. Điều kiện nuôi cấy in vitro 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tạo mẫu đậu xanh sạch in vitro Bảng 1: Tạo mẫu đậu xanh sạch in vitro sau 4 ngày nuôi cấy Bảng 1: Kết quả mẫu đậu xanh sạch in vitro sau 4 ngày nuôi cấy 3.1 Tạo mẫu đậu xanh sạch in vitro Bảng 1: Kết quả mẫu đậu xanh sạch in vitro sau 4 ngày nuôi cấy 3.1. Tạo mẫu đậu xanh sạch in vitro Bảng 2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá sau 4 tuần nuôi cấy 3.2. Tạo mô sẹo từ mảnh lá 3.2 Tạo mô sẹo từ mảnh lá Bảng 2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá sau 4 tuần nuôi cấy Hình 1: Tạo mô sẹo từ mảnh lá trên môi trường H3 3.3. Tạo mô sẹo từ thân Hình 2: Mô sẹo từ thân mầm trên môi trường H3 Hình 3: Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ thân cây Hình 4: Mô sẹo từ mảnh lá trên môi trường tái sinh 4 tuần Hình 5: Mô sẹo từ thân cây trên môi trường tái sinh 4 tuần 3.4. Tạo đa chồi từ nốt lá mầm Hình 6: Tạo đa chồi từ nốt lá mầm trên môi trường T5 Hình 7: Hệ số tạo chồi từ nốt lá mầm 3.5. Tạo đa chồi từ chồi ngọn Hình 8: Ảnh hưởng của chất KTST đến khả năng tạo đa chồi từ chồi ngọn Hình 9: Tạo đa chồi trên môi trường T5 3.6. Tạo đa chồi từ đốt thân Hình 10: Tạo đa chồi từ đốt thân trên môi trường T5 Hình 11: Hệ số tạo chồi từ đốt thân 3.7. Môi trường kéo dài chồi Hình 12: Ảnh hưởng của GA3 tới khả năng kéo dài chồi Hình 13: Kéo dài chồi đậu xanh từ nốt lá mầm trên môi trường K2 3.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và NAA  tới khả năng ra rễ Bảng 3: Ảnh hưởng của IBA và NAA tới khả năng hình thành rễ Hình 14: Tạo rễ trên môi trường R1 Hình 15: Tạo cây hoàn chỉnh Hình 16: Tạo rễ trên môi trường R4 (17 ngày) Hình 17: Tạo rễ trên môi trường R4 (17 ngày) 3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ra rễ tới sức sống của cây Hình 18: Ảnh hưởng của thời gian ra rễ tới sức sống của cây Hình 19: Cây đậu xanh tái sinh trồng trên trấu hun 3.10. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể  tới sức sống của cây Bảng 4: Ảnh hưởng của giá thể tới sức sống của cây đậu xanh Hình 20: Cây tái sinh trồng trên cát Hình 21: Cây tái sinh trồng trên cát + trấu hun Hình 22: Cây tái sinh trồng trên trấu hun Hình 23: Cây đậu xanh tái sinh ra hoa và kết quả Phôi hạt chín Cây mầm ( MS+20g/l sucrose+9g/l agar) Tạo đa chồi từ nốt lá mầm Tạo đa chồi từ đoạn chồi, đốt thân Môi trường kéo dài chồi MS+20g/l sucrose+9g/l agar+1mg/l GA3 Môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS+20g/l sucrose+9g/l agar+0,1mg/l IBA Huận luyện, chăm sóc cây Vườn ươm Giá thể cát + trấu hun (1:1) 3 ngày 6 ngày 15 ngày 30 ngày 15 ngày 12 ngày 15 ngày TÓM TẮT QUY TRÌNH TẠO ĐA CHỒI ĐẬU XANH 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Bước đầu đã xây dựng được hệ thống nuôi cấy in vitro của cây đậu xanh phục vụ mục đích chuyển gene thông qua tạo đa chồi từ nốt lá mầm, đốt thân và chồi ngọn. Môi trường tạo đa chồi là T2 (2mg/l BAP + 10% nước dừa). Hệ số tạo chồi từ đốt thân là 3,4; từ nốt lá mầm là 3,8 và từ chồi ngọn là 6,5. Đã xác định được môi trường kéo dài chồi đậu xanh là MS cơ bản có bổ sung 1mg/l GA3. Đã xác đinh được môi trường tạo cây hoàn chỉnh là MS cơ bản có bổ sung 0,1mg/l IBA trong thời gian nuôi cấy là 12 ngày. Đã xác định được giá thể phù hợp là cát + trấu hun tỷ lệ 1:1 để trồng cây in vitro, với tỷ lệ cây sống là 100%. Cây đậu xanh nuôi cấy in vitro sinh trưởng và phát triển bình thường ở điều kiện tự nhiên. 4.2. Đề nghị Tiếp tục ứng dụng hệ thống nuôi cấy in vitro này để chuyển các gene có giá trị kinh tế vào cây đậu xanh. XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!