Luận văn Nghiên cứu khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp của một số loài vi khuẩn Vibrio trên tôm nuôi nước lợ tại một số tỉnh phía Bắc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ............
............ TRẦN ANH TUẤN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP CỦA MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM NUÔI NƯỚC LỢ TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC . LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ............
............ TRẦN ANH TUẤN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP CỦA MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM NUÔI NƯỚC LỢ TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN Mà SỐ: 60.62.03.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN THỊ VÂN HÀ NỘI - 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Anh Tuấn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo, Phòng Hợp tác Quốc tế và Đào tạo - Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1, Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Cơ quan Thú y vùng III đã ủng hộ, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt khóa học này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới cô giáo hướng dẫn, TS. Phan Thị Vân, người đã tận tình định hướng, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Qua đây, tôi xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Quan trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực phía Bắc – Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 và các cán bộ thuộc đề tài “Tôm khẩn cấp năm 2013” đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài. Lời cảm ơn chân thành xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp, những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Hà Nội 20 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Trần Anh Tuấn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii MỤC LỤC ....................................................................................................................iii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... vi DANH MỤC VIẾT TẮT.............................................................................. vii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1 Tính cấp thiết của đề tài .................................................................... 1 2 Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................... 2 3 Nội dung nghiên cứu ......................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1 Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu ......................................... 3 1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái vi khuẩnVibrio ............................... 3 1.1.2 Đặc tính phân bố và nuôi cấy ............................................................ 4 1.1.3 Đặc tính sinh hóa .............................................................................. 5 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Vibrio spp trên tôm ............. 8 1.2.1 Trên thế giới ..................................................................................... 8 1.2.2 Ở Việt Nam ..................................................................................... 15 1.3 Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ .................. 18 1.3.1 Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên thế giới ................................. 18 1.3.2 Tình hình hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở Việt Nam ...................... 18 1.4 Các nghiên cứu liên quan đến hiện tượng hoại tử gan tụy ở tôm nuôi ........ 20 1.4.1 Hoại tử gan tụy tôm do MBV và HPV ............................................ 20 1.4.2 Hoại tử gan tụy tôm do vi khuẩn ký sinh nội bào (Necrotizing Hepatopancreatitic, NHP) ............................................................... 20 1.4.3 Hoại tử gan tụy do vi bào tử trùng ................................................... 21 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 1.4.4 Hoại tử gan tụy do độc chất ............................................................ 21 1.4.5 Bệnh hoại tử gan tụy cấp ................................................................. 23 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 27 2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu .................................................. 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 27 2.1.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 27 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu ....................................................... 27 2.2.1 Thời gian nghiên cứu ...................................................................... 27 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 27 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................... 27 2.3.1 Xác định AHPND ........................................................................... 27 2.3.2 Phân lập và định danh vi khuẩn (Frerichs và Millar (1983, 1993) ......... 30 2.3.3 Xác định độc lực của vi khuẩn: ....................................................... 33 2.3.4 Thử kháng sinh đồ (Kibry-Bauer) ................................................... 36 2.4 Phương pháp xử lí số liệu ................................................................ 36 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................... 37 3.1 Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND .................... 37 3.2 Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực ................................... 40 3.3 Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được ..... 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 51 1. Kết luận .......................................................................................... 51 2. Đề xuất ........................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác nhân gây bệnh ở động vật thuỷ sản (Buller, 2004) ............................ 7 Bảng 2.1 Cách thực hiện và đọc các phản ứng sinh hóa................................ 32 Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ............................................................. 37 Bảng 3.2 Kết quả phân tích mẫu theo phương pháp mô ................................ 39 Bảng 3.3 Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 1 ..... 41 Bảng 3.4 Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 2 ..... 42 Bảng 3.5 Kết quả tái phân lập vi khuẩn thí nghiệm 3.................................... 44 Bảng 3.6 Kết quả phân tích mô bệnh học thí nghiệm 3 ................................. 45 Bảng 3.7 Tính nhạy, trung bình của một số loài vi khuẩn đối với một số loại kháng sinh ................................................................................ 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG Hình 1.1:Vi khuẩn V. parahaemolyticus ......................................................... 3 Hình 1.2: Vi khuẩn V. vulnificus..................................................................... 3 Hình 1.3: Vi khuẩn V. harveyi ........................................................................ 4 Hình 1.4: Vi khuẩn V. alginolyticus ................................................................ 4 Hình 1.5: Khuẩn lạc vi khuẩn V. harveyi ....................................................... 5 Hình 1.6: Khuẩn lạc vi khuẩn V. Parahaemolyticus ...................................... 5 Hình 1.7: Nhuộm gram vi khuẩn V.Vulnificus ............................................... 5 Hình 1.8: Phản ứng Indol trên V. parahaemolyticus ...................................... 5 Hình 1.9: Dấu hiệu nhận biết AHPND theo phương pháp mô bệnh học ....... 24 Hình 2.1: Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 36 Hình 3.1: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nghệ An ..................................... 38 Hình 3.2: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nam Định Hình 3.3: Hình ảnh soi vi khuẩn trên kính hiển vi ........................................ 39 Hình 3.4: Thử sinh hóa V. paraheamolyticus tái phân được ......................... 45 Hình 3.5: Tổ chức mô của tôm bị AHPND ................................................... 46 Hình 3.6: Kháng sinh đồ V.paraheamolyticus (12.020) ................................ 49 Hình 3.7: Kháng sinh đồ V. vulnificus và V.paraheamolyticus (13.014) ....... 49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AHPND: Acute Hepatopancreatic Necrosis Dsease CTVK: Công thức vi khuẩn ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long EMS: Early Mortality Syndrome HPV: Hepatopancreatic Pavovirrus IHHNV: Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus IMNV: Infectious Myonecrosis Virus MBV: Monodon Baculovirus NACA: Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific NHP: Necrotizing Hepatopancreatitis NTTS: Nuôi Trồng Thủy Sản PCR: Polymerase Chain Reaction Thuốc BVTV: Thuốc Bảo vệ thực vật TSV: Taura Syndrome Virus Viện NCNTTS: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản YHV: Yellow Head Virus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài Nuôi tôm nước lợ là một hình thức nuôi quan trọng đem lại giá trị kinh tế cao, chiếm hơn 40% tổng giá trị sản phẩm nuôi trồng thủy sản ở nước ta. Trong các loài được nuôi ở nước lợ, tôm sú và tôm thẻ chân trắng là những loài được nuôi phổ biến trên địa bàn cả nước ta với gần 80% tổng diện tích nuôi trồng nước lợ (FAO, 2012). Hình thức nuôi này đóng một vai trò to lớn trong tổng giá trị nuôi trồng thủy sản tiêu thụ trong nước cũng như giá trị xuất khẩu sang nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, người nuôi tôm nước lợ đang phải đối mặt với nhiều loại dịch bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn, trong đó phải kể đến bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND). Đây là một loại dịch bệnh mới xuất hiện ở nước ta từ giữa năm 2010, gây chết tôm sú và tôm thẻ chân trắng hàng loạt trên địa bàn Đồng bằng song Cửu Long. Trong 2 năm tiếp theo, 2011 và 2012, dịch bệnh tiếp tục lan rộng ra nhiều tỉnh khác, tập trung tại Trà Vinh, Sóc trăng, Kiên Giang và ở một số tỉnh ven biển phía Bắc: Hải Phòng và Quảng Ninh, Bắc Trung bộ: Thanh Hóa và Nghệ An, Nam Trung bộ: Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận. Do diện tích tôm mắc bệnh rất lớn và tôm chết tập trung chủ yếu ở giai đoạn 20 - 30 ngày tuổi, đây là cỡ tôm khi phát hiện bệnh người nuôi thường xử lý và xả bỏ nên gây thiệt hại rất lớn. Đặc biệt trong năm 2012, cả nước có khoảng 100.776 ha diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh thì có tới 46.093 ha diện tích nuôi tôm nước lợ được xác định là bị chết do hội chứng hoại tử gan tụy (Tổng cục Thủy sản, 2012). Trong thời gian qua, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định nguyên nhân gây dịch bệnh. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng hội chứng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 này có liên quan trực tiếp đến thuốc bảo vệ thực vật và tảo độc, trong khi đó, một số nghiên cứu khác lại cho rằng có mối quan hệ chặt chẽ giữa việc sử dụng thức ăn và các chế phẩm sinh học trong nuôi trổng thủy sản với hội chứng hoại tử gan tụy. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây tìm thấy nhiều loại vi khuẩn ở tôm bị hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở tất cả các vùng nuôi tôm trong đó vi khuẩn Vibrio chiếm thành phần chủ yếu và phổ biến nhất là các loài V. parahaemolyticus, V. vulnificus,V. harveyi. Cụ thể là, một nghiên cứu của giáo sư Lightner và cộng sự (2013) đã chỉ ra một chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus là tác nhân gây ra hội chứng này. Với mục đích làm rõ sự liên quan của nhóm vi khuẩn Vibrio đến bệnh hoại tử gan tụy cấp, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp của một số loài vi khuẩn vibrio trên tôm nuôi nước lợ tại một số tỉnh phía Bắc”. Đây là một đề tài nhỏ thuộc đề tàii “Nghiên cứu nguyên nhân, tác nhân gây hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng và biện pháp khắc phục” của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn giao cho Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1 chủ trì trong năm 2013. 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định các loài vi khuẩn Vibrio độc lực trên tôm sú, tôm thẻ chân trắng bị AHPND. 3 Nội dung nghiên cứu - Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND - Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực - Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái vi khuẩnVibrio Hệ thống phân loại (Ackermann, 1984): Ngành Proteobacteria Lớp Gammaproteobacteria Bộ Vibrionales Họ Vibrionaceae Veron, 1965 Giống Vibrio Pacini, 1854 Loài Vibrio spp Hình thái: Đặc điểm chung của các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5x1,4-2,6 µm; chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh. Hình 1.1:Vi khuẩn V. parahaemolyticus Hình 1.2: Vi khuẩn V. vulnificus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4 (Buller, 2004) (Buller, 2004) Hình 1.3: Vi khuẩn V. harveyi (Buller, 2004) Hình 1.4: Vi khuẩn V. alginolyticus (Buller, 2004) 1.1.2 Đặc tính phân bố và nuôi cấy Ngoài tự nhiên vi khuẩn Vibrio phân bố rất phổ biến trong môi trường nước biển và vùng nước lợ ven biển; có thể tìm thấy chúng trong các tầng nước, vùi trong trầm tích đáy hoặc bám trên bề mặt của các sinh vật sống trong vùng nước đó. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 20-300C (Bùi Quang Tề và cộng sự, 2004). Trong môi trường nuôi cấy tất cả các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều cần muối NaCl để phát triển, nồng độ muối cho phép trong môi trường nuôi cấy thường là 1-2 %. TCBS là môi trường chọn lọc của các loài vi khuẩn Vibrio, sau 18-24h nuôi cấy hình thành khuẩn lạc với kích thước khoảng 2–5mm, có màu vàng (V. cholerae, V. alginolyticus, V. fluvialis) hoặc xanh (V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus). Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 Hình 1.5: Khuẩn lạc vi khuẩn V. harveyi (Buller, 2004) Hình 1.6: Khuẩn lạc vi khuẩn V. Parahaemolyticus (Buller, 2004) 1.1.3 Đặc tính sinh hóa Các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều yếm khí tuỳ tiện, hầu hết là oxy hoá và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn cảm với Vibriostat (0/129) (Bùi Quang Tề và cộng sự, 2004). Hình 1.7: Nhuộm gram vi khuẩn V.Vulnificus (Buller, 2004) Hình 1.8: Phản ứng Indol trên V. parahaemolyticus (Buller, 2004) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6 Bên trái: (-); Bên phải: (+) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7 Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác nhân gây bệnh ở động vật thuỷ sản (Buller, 2004) Đặc điểm sinh hóa 1 2 3 4 5 6 Nhuộm Gram - - - - - - Di động + + + + + + Phản ứng Oxydase + + + + + + Phát sáng + + - - - - Phát triển ở nhiệt độ 40C - - - - - + Phát triển ở 370C + + + + + - Phát triển ở 0%NaCl - - - - - - Phát triển ở 3%NaCl + + + + + + Phát triển ở 7%NaCl + + + - - - Nhậy cảm 0/129 (10 µg) S S R S S S Nhậy cảm 0/129(150 µg) S S S S S S Màu khuẩn lạc trênTCBS xanh xanh vàng vàng xanh - Thử O/F Glucose +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ β galactosidase - + + - Arginine dihydrolase - - - - - - Lysine Decarboxylase + + + - + - Orinithine Decarboxylase + - + - - - Phản ứng Citrate + - d + + - Phản ứng Urease - - - - - - Khử Nitrate NO3→NO2 + + + + + - Indol + + + + - - Sinh H2S - - - - - - Methyl red - + - d - Voges-Proskauer (V-P) - - + + - - Dịch hóa Gelatin + + + + + - Axit hoḠArabinose d - - + - - Axit hoḠGlucose + + + + + + Axit hoḠInositol - - - - - - Axit hoḠMannitol + + + + - D Axit hoḠSalicin - - - - - - Axit hoḠSorbitol - - + - - Axit hoḠSucrose - - + + - - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 Chú thích: 1 - Vibrio parahaemolyticus 4 - Vibrio anguillarum 2 - Vibrio harveyi 5 - Vibrio vulnificus 3 - Vibrio alginolyticus 6 - Vibrio salmonicida " + " > 90 % các chủng phản ứng dương " - " < 90 % các chủng phản ứng âm “ d " 11 - 89 % các chủng phản ứng dương “ R ": Không mẫn cảm “ S ": Mẫn cảm n: Chưa có số liệu. 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Vibrio spp trên tôm 1.2.1 Trên thế giới Dịch bệnh xảy ra và những thiệt hại to lớn của nó là động lực thúc đẩy sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học và cùng với nhu cầu cấp thiết của nền sản xuất mà trong một thời gian ngắn, hàng loạt các thành tựu nghiên cứu bệnh tôm đã được công bố và áp dụng. Dựa vào tác nhân gây bệnh, các nhà khoa học chia bệnh thủy sản ra thành những bệnh chủ yếu sau: Bệnh do virus, bệnh do vi khuẩn, bệnh do nấm, bệnh do ký sinh trùng và một số bệnh do các yếu tố vô sinh gây ra ở tôm. Trong số các tác nhân gây bệnh ở tôm nuôi thì vi khuẩn là một trong những tác nhân thường gặp, được coi là có ảnh hưởng kinh tế rất lớn tới các trang trại nuôi tôm trên toàn thế giới (Venkateswara Rao và cộng sự, 2010). Trong điều kiện ao nuôi có mật độ cao, đầu tư thức ăn lớn, hiện tượng ô nhiễm thường xuyên xảy ra tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và gây tác hại. Theo thống kê của Sindermann và Lighter (1988), các bệnh ở tôm do vi khuẩn gây ra chiếm 45,5% trong tổng số các loại bệnh, trong khi virus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9 chỉ chiếm 25,3%, nấm chiếm 2,7%, ký sinh trùng chiếm 26,5%. Bệnh do vi khuẩn chủ yếu là các bệnh do Vibrio gây ra, chúng được báo cáo trong các hệ thống nuôi tôm trên toàn thế giới gồm có ít nhất 14 loài: Vibrio harveyi, V. splendidus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum, V. vulnificus, V. campbelli, V. fischeri, V. damsella, V. pelagicus, V. orientalis, V. ordalii, V. mediterrani và V. logei. Theo Venkateswara Rao và cộng sự, 2010, Vibriosis là bệnh vi khuẩn có liên quan đến tỉ lệ chết ở tôm nuôi trên toàn thế giới. Sự nhiễm vi khuẩ