Luận văn Nghiên cứu nấm đối kháng trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm aspergillus flavus link. hai lạc tại Nghệ An

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- HỒ THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma PHÒNG TRỪ BỆNH MỐC VÀNG DO NẤM Aspergillus flavus Link. HAỊ LAC̣ TAỊ NGHÊ ̣AN CHUYÊN NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62.62.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: 1. GS.TS. VŨ TRIỆU MÂN 2. PGS. TS. NGUYỄN VĂN VIẾT Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao được dùng làm thực phẩm và xuất khẩu. Ở nước ta vùng Bắc Trung Bộ có diện tích trồng lạc lớn nhất so với 24 tỉnh thành trồng lạc trong cả nước, chiếm 22,5% tổng diện tích trồng và 21,6% tổng sản lượng lạc trên cả nước. Diện tích trồng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa tương ứng là 16200 ha chiếm 8,1%; 16000 ha chiếm 8,0%; 12800 ha chiếm 6,4% tương ứng so với cả nước. Sản lượng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa là 37300 tấn chiếm 8,3%; 36900 tấn chiếm 8,2%; 23600 tấn tương ứng, chiếm 5,2% cả nước (Tổng cục thống kê, 2015). Bệnh mốc vàng hại lạc do nấm Aspergillus flavus Link. gây ra là đối tượng hại có ý nghĩa kinh tế quan trọng với cây lạc. Nấm A. flavus có khả năng sinh độc tố aflatoxin, có thể gây ung thư và một số bệnh nguy hiểm trên người và động vật. Các nghiên cứu về nấm A.flavus và sự hình thành aflatoxin trên lạc và các sản phẩm từ lạc trên thế giới được tiến hành toàn diện và hệ thống, với gần 2000 công trình được xuất bản (Mehan et al. 1991). Lê Văn Giang cs. (2011), khảo sát trên 60 mẫu lạc ở Nghệ An, có 59 mẫu (98,30%) bị nhiễm nấm A. flavus, trong đó 30 mẫu (50,0%) sinh độc tố aflatoxin từ 2 – 100 ppb và 10 mẫu (16,67%) vượt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế. Đây chính là mối nguy hại cho sức khỏe đối với người sử dụng những sản phẩm lạc này. Nghiên cứu của Torres et al. (2014) đã tóm tắt những tiến bộ gần đây ở các quốc gia trồng lạc trên thế giới về các phương pháp ngăn ngừa ô nhiễm aflatoxin trên lạc. Trong đó, tập trung chủ yếu vào các chiến lược trước thu hoạch, nhấn mạnh đến các hướng nghiên cứu cần tập trung trong tương lai bao gồm: chọn tạo giống lạc kháng nấm, kiểm soát sinh học và sử dụng ozon để giảm ô nhiễm aflatoxin trên lạc. Tại Việt Nam nghiên cứu phòng trừ nấm mốc A. flavus đã có một số thành công. Bên cạnh các biện pháp canh tác và bảo quản được áp dụng để phòng chống bệnh, các tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu năm 2010-2011 đã phân lập, tuyển chọn được các dòng nấm A. flavus TH97, DA2 không sinh độc tố dùng trong phòng trừ các dòng nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin. Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ đã tuyển chọn thành công giống lạc L17 có khả năng kháng nấm A.flavus (Nguyễn Văn Thắng, 2010). Chúng ta đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các chế phẩm sản xuất từ nấm Trichoderma chống các bệnh thối rễ, chết ẻo do các nấm Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii gây ra. Mặc dù vậy, hướng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nấm mốc A. flavus nhằm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như các cây trồng khác chưa được quan tâm. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc tại Nghệ An” đã được tiến hành nhằm tuyển chọn và ứng dụng được nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ bệnh mốc vàng hại lạc. 2. Mục đích và yêu cầu 2.1. Mục đích Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại cây lạc trồng tại Nghệ An và xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng. 2 2.2. Yêu cầu Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An. Xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án bổ sung những thông tin mới về tuyển chọn sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum được phân lập từ vùng đất trồng lạc để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. Kết quả luận án là tài liệu phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và phục vụ sản xuất. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng chế phẩm Trichoderma asperellum để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An, không những làm giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và trong quá trình bảo quản, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc mà còn góp phần bảo vệ môi trường và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu Các loài nấm Trichoderma được phân lập từ các mẫu đất trồng lạc, sử dụng trong phòng trừ nấm A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao và sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma có khả năng phòng trừ hiệu quả nấm mốc Aspergillus flavus trên cây lạc và ứng dụng rộng rãi cho vùng chuyên canh lạc tỉnh Nghệ An. 5. Những đóng góp mới của luận án - Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum được phân lập từ vùng đất trồng lạc để chuyên phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. - Ứng dụng thành công các kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào trình tự vùng gen ITS để định danh các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc hại lạc A. flavus. - Đề xuất được quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma asperellum đạt nồng độ 5,3 × 109 bào tử/gam. Chế phẩm T. asperellum có tác dụng giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và giảm độc tố aflatoxin trong quá trình bảo quản đạt 92,08%, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc. 6. Cấu trúc của luận án Luận án dày 155 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 37 bảng số liệu, 9 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 32 trang; Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 56 trang; Kết luận và kiến nghị 02 trang. Đã tham khảo 138 tài liệu bao gồm 40 tài liệu tiếng Việt và 97 tài liệu tiếng Anh, Phụ lục 21 trang. 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các xu hướng kiểm soát sinh học A. flavus sinh độc tố aflatoxin trên thế giới hiện nay với 3 hướng chính là: (i) Hướng nghiên cứu sử dụng Bacillus (B. pumilus, B. subtilis) (Munimbazi et al., 1998;); (ii) Hướng nghiên cứu sử dụng các chủng A. flavus, A. parasiticus không sinh độc tố, đã có những thành công, đặc biệt là ở Hoa Kỳ, như chủng A. flavus AF36 (Cotty, 1994); (iii) Hướng nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma đã có những thành công nhất định, đặc biệt ở Ấn Độ, như sử dụng 5 loài T. harzianum, T. viride, T. auroviride, T. longibrachiatum, T. hamatum kiểm soát sinh học A. flavus sinh độc tố aflatoxin (Reddy et al., 2010). 1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Cho đến nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số loại bệnh do nấm gây ra hại rễ cây trồng và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma sản xuất phân hữu cơ sinh học nhưng hướng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để làm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như các cây trồng khác chưa được quan tâm. Đã có các chế phẩm từ nấm Trichoderma chống được các loại nấm bệnh cây trồng gây bệnh thối rễ, chết yểu, xì mủ, do các nấm bệnh gây nên (Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii, ) nhưng chưa có chế phẩm nào chuyên phòng trừ nấm A. flavus. Các nghiên cứu trong nước phòng trừ nấm mốc A. flavus sinh độc tố aflatoxin đã có thành công ở một số hướng như: dùng nấm A. flavus không sinh độc tố (chủng A. flavus TH97 của Nguyễn Thị Xuân Sâm, A. flavus DA2 của Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu; chọn tạo giống kháng nấm A. flavus như giống lạc D8 (hay L17) của Nguyễn Văn Thắng (Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ)...; ngoài ra kết hợp với các biện pháp canh tác và biện pháp bảo quản sau thu hoạch. 1.3. Những tồn tại và vấn đề đề tài tập trung nghiên cứu Nghiên cứu Trichoderma phòng trừ A. flavus đang được quan tâm nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt là Ấn Độ. Ở Việt Nam, cho đến nay mới chỉ có những công trình nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số loại bệnh do nấm gây ra hại rễ cây trồng như Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsiivà ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma vào sản xuất phân hữu cơ sinh học. Việc nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để làm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như các cây trồng khác chưa được quan tâm. Vì vậy, nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát nấm A. flavus gây bệnh mốc vàng trên lạc, giảm thiểu được hàm lượng aflatoxin sẽ giúp nâng cao chất lượng nông sản, có ý nghĩa trong ứng dụng vào sản xuất lạc. CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu đất trồng lạc để phân lập Trichoderma; mẫu đất trồng lạc để đánh giá tỷ lệ nhiễm A. flavus; mẫu hạt lạc giống thu từ nhà dân; mẫu hạt lạc giống thu từ các chợ. - Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma được sản xuất từ nguồn nấm Trichoderma asperellum (Tri.020(2).NC), lượng bào tử 5,3 × 109 bt/g. - Các loại môi trường nuôi cấy: PDA, WA 0,01%, CAM; hóa chất trong phân tích DNA các nguồn nấm Trichoderma. 4 2.2. Thiết bị và dụng cụ Tủ hấp khử trùng, buồng nuôi cấy vi sinh, tủ sấy, đĩa petri, ống nghiệm 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Các nghiên cứu được tiến hành tại Nghệ An, phân tích DNA được thực hiện tại Trung tâm BIOTEC (Thái Lan). Thời gian nghiên cứu từ năm 2011 - 2015. 2.4. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt giống và đất trồng lạc tại Nghệ An. - Thu thập, phân lập và tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An. - Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm Trichoderma phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An. - Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An. 2.5. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt giống và đất trồng lạc tại Nghệ An theo phương pháp của Lester W. Burgess (2009); Mathur S.B (2000), Lin và Dianese (1976); Hamed et al. (2004). Thu thập, phân lập, tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An theo phương pháp của Rahman et al. (2009), Skidmore and Dickinson (1976) và Dennis et al. (1971). Định loại của các nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với A. flavus bằng công nghệ sinh học phân tử: Chiết xuất DNA: theo phương pháp Cirad Protocol, dùng cặp mồi vùng ITS rDNA, phản ứng PCR, tinh chiết sản phẩm PCR: bẳng bộ kít Aquick PCR Purification Kit, gửi sản phẩm PCR sang Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) để giải trình tự gen, hoàn thiện lại trình tự gen bằng phần mền Bioedit. Căn chuỗi trình tự bằng phần mềm ClustalX 2.1. Dùng phần mềm trực tuyến chuyên cho nấm Trichoderma là TrichOKEY v. 2.0 để định danh loài. Dùng phần mềm MEGA v.6 để xây dựng cây phát sinh loài. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc: nghiên cứu môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp 2, môi trường nhân sinh khối và các tỷ lệ nước/cơ chất, chế độ đảo trộn cấp khí và chiếu sáng theo phương pháp thường quy trong bảo vệ thực vật và kế thừa các nghiên cứu trước của Trần Thị Thuần và cs. (1995), Nguyễn Hồng Tuyên và cs. (2013) và Trần Thị Thúy (2013). Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc trong điều kiện nhà lưới, đồng ruộng và trên mô hình theo phương pháp của Srilakshmi (2001), Thakur (2003) và Lester W. Burgess (2009), (Askew & Laing 1993) và Mathur S.B và Olga K., 2000. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc và đất trồng lạc tại Nghệ An 3.1.1. Thành phần nấm hại hạt lạc tại Nghệ An năm 2012 Các mẫu hạt lạc đã được thu thập ở các huyện Nghi Lộc, Nam Đàn, Yên Thành, Diễn Châu, Hưng Nguyên, Anh Sơn và thành phố Vinh. Đã xác định được 6 loài nấm gây hại chính trên các mẫu lạc được thu thập: có 6 loài nấm thuộc 4 bộ gây hại chính trên hạt lạc Xuất hiện phổ biến là các loài nấm A. niger, A. flavus, và Penicillium sp. 5 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ các chợ Nghệ An năm 2012 Đã tiến hành các đợt thu thập, phân lập nấm gây bệnh trên 245 mẫu hạt lạc từ các chợ khu vực Nghi Lộc và thành phố Vinh, để đánh giá mức độ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc tại các chợ của khu vực này. Tỷ lệ mẫu hạt lạc nhiễm nấm A. flavus ở các chợ khá cao từ 28,6 – 51,4%, cao nhất là chợ Nghi Ân với số mẫu bị nhiễm chiếm đến 51,4%. Tỷ lệ mẫu hạt lạc nhiễm A. flavus thấp nhất ở chợ Quán Lau – Thành phố Vinh. Các chợ khu vực Nghi Lộc có tỷ lệ số mẫu nhiễm A. flavus khá cao và khá đều nhau giữa các chợ, từ 45,7 – 51,4 %. Các chợ trong khu vực thành phố Vinh: Chợ Ga, chợ Quang Trung, chợ Quán Lau, chợ Vinh có tỷ lệ nhiễm mẫu nhiễm nấm A. flavus thấp hơn Nghi Lộc từ 28,6 – 51,4%. 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ nông hộ Nghệ An năm 2012 Mẫu hạt lạc giống thu từ nông hộ có tỷ lệ nhiễm A. flavus từ 15,6 – 64,4%. Tại huyện Nghi Lộc, tỷ lệ mẫu lạc nhiễm A. flavus cao nhất ở xã Nghi Phong 64,4%, sau đó là Nghi Trung 60,0%. Các xã còn lại của Nghi Lộc như Nghi Ân, Nghi Trường và Nghi Long tỷ lệ hạt lạc nhiễm A. flavus thấp hơn chiếm từ 35,6 – 37,8%. Các xã Hưng Thông – Hưng Nguyên, Kim Liên – Nam Đàn và Diễn An – Diễn Châu có số mẫu lạc giống nhiễm nấm A. flavus từ 44,4 – 51,1 %. Thấp nhất ở Đỉnh Sơn – Anh Sơn với 15,6 % số mẫu bị nhiễm nấm A. flavus. 3.1.4. Thành phần nấm hại trong đất trồng lạc tại Nghệ An năm 2012 Thành phần nấm bệnh trong đất trồng lạc ở 3 xã Nghi Trường, Nghi Ân, Nghi Phong của huyện Nghi Lộc và vùng phụ cận vụ xuân năm 2012 gồm 11 loài thuộc 6 bộ và 6 họ khác nhau. Các loài nấm phổ biến là loài A. flavus gây bệnh mốc vàng, loài A. niger gây bệnh héo rũ gốc mốc đen, Penicillium sp. gây mốc xanh trên lạc. 3.1.5. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên đất trồng lạc của các điểm điều tra tại Nghệ An năm 2012 Đánh giá tỷ lệ nhiễm A. flavus trên 420 mẫu đất được thu từ các vùng trồng lạc Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Quỳnh Lưu: Tỷ lê ̣nhiêm̃ A. flavus trên đất trồng lac̣, chỉ từ 3,3-20,0%, ở các vùng luân canh lúa lac̣ tỷ lê ̣mẫu đất nhiêm̃ A. flavus thấp. Điều kiêṇ gieo trồng và giai đoaṇ phát triển của lac̣ cũng ảnh hưởng đến tỷ lê ̣ nhiêm̃ A. flavus trong đất. Mâũ đất thu đươc̣ trên vùng đất cát pha như Nghi Lôc̣, Hưng Nguyên và Quỳnh Lưu vào giai đoaṇ ra hoa hình thành củ không có tưới có tỷ lê ̣ nhiêm̃ A. flavus từ 10,0- 20,0% cao hơn so với các mâũ đất thu ở Nam Đàn, Diêñ Châu vào giai đoaṇ đẻ nhánh trên vùng đất cát pha có tưới nước (3,3-5,0%). 3.1.6. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh Với 107 mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các chợ, trong đó 51 mẫu của các chợ ở Nghi Lộc và 56 mẫu của các chợ thành phố Vinh cho thấy: Tỷ lệ các mẫu nấm A. flavus được phân lập từ hạt lạc thu từ các chợ sinh độc tố aflatoxin từ 71,43-83,33%. Các chợ của Nghi Lộc trung bình có 80,39% số mẫu A. flavus sinh độc tố aflatoxin. Các chợ của thành phố Vinh trung bình có 76,79% mẫu A. flavus sinh aflatoxin. Trên tổng số 107 mẫu A. flavus thu từ các chợ có 84 mẫu sinh độc tố aflatoxin chiếm 78,50% (bảng 3.1). 6 Bảng 3.1. Số lượng các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh sinh độc tố aflatoxin Tổng mẫu Màu sắc trên môi trường CAM Màu sắc dưới đèn UV Tổng số mẫu sinh aflatoxin Tỷ lệ mẫu sinh aflatoxin Trắng Vàng nhạt Vàng sẫm Tím Xanh Nghi Lộc 51 5 15 31 10 41 41 80,39 Chợ Nghi Ân 18 1 5 12 3 15 15 83,33 Chợ Sơn 17 3 5 9 4 13 13 76,47 Chợ Mới 16 1 5 10 3 13 13 81,25 Thành phố Vinh 56 5 16 35 13 43 43 76,79 Chợ Ga 16 1 6 9 3 13 13 81,25 Chợ Vinh 16 1 4 11 4 12 12 75,00 Chợ Quán Lau 10 2 2 6 2 8 8 80,00 Chợ Quang Trung 14 1 4 9 4 10 10 71,43 Tổng 107 10 31 66 23 84 84 78,50 3.1.7. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An Khả năng sinh độc tố aflatoxin của 191 mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các nông hộ Nghệ An được trình bày trong bảng 3.2. Tỷ lệ mẫu nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin cao ở hầu hết các nông hộ từ 73,91-100%, trung bình chiếm 81,68% (bảng 3.2). Bảng 3.2. Số lượng các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An sinh độc tố aflatoxin Địa điểm Tổng mẫu Màu sắc trên môi trường CAM Màu sắc dưới đèn UV Tổng số mẫu sinh aflatoxin Tỷ lệ mẫu sinh aflatoxin Trắng Vàng nhạt Vàng sẫm Tím Xanh Nghi Lộc 105 16 33 56 18 87 87 82,86 Hưng Nguyên 20 3 2 15 3 17 17 85,00 Nam Đàn 23 5 7 11 6 17 17 73,91 Diễn Châu 20 3 7 10 4 16 16 80,00 Yên Thành 16 4 4 8 4 12 12 75,00 Anh Sơn 7 0 4 3 0 7 7 100,00 Tổng 191 31 57 103 35 156 156 81,68 3.1.8. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A.flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An Bảng 3.3 cho thấy nuôi cấy trên môi trường CAM 49 mẫu nấm A. flavus phân lập được từ đất trồng lạc của Nghệ An: có 28 mẫu A. flavus có màu vàng sẫm, 12 mẫu có màu vàng nhạt và 9 mẫu có màu trắng; dưới đèn UV có 38 mẫu A. flavus quan sát thấy huỳnh quang màu xanh, 11 mẫu có huỳnh quang màu tím. Như vậy, với 49 mẫu isolate A. flavus phân lập được từ đất trồng lạc Nghệ An có 38 mẫu sinh độc tố aflatoxin chiếm 77,55%. 7 Bảng 3.3. Số lượng các mẫu nấm A. flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An sinh độc tố aflatoxin Địa điểm Tổng mẫu Màu sắc trên môi trường CAM Màu sắc dưới đèn UV Tổng số mẫu sinh aflatoxin Tỷ lệ mẫu sinh aflatoxin Trắng Vàng nhạt Vàng sẫm Tím Xanh Nghi Lộc 23 3 7 13 4 19 19 82,61 Hưng Nguyên 9 2 2 5 2 7 7 77,78 Nam Đàn 2 1 0 1 1 1 1 50,00 Diễn Châu 3 2 0 1 2 1 1 33,33 Quỳnh Lưu 12 1 3 8 2 10 10 83,33 Tổng 49 9 12 28 11 38 38 77,55 3.2. Thu thập, phân lập và tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An 3.2.1. Thu thập và phân lập nấm đối kháng Trichoderma trên đất trồng lạc Tần suất xuất hiện của nấm Trichoderma trên 1000 mẫu đất trồng lạc thu tại Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh. Số mẫu đất trồng lạc có nấm Trichoderma của Nghệ An chiếm 44,30%, Thanh Hoá 52,00% và Hà Tĩnh 39,50%. Trong tỉnh Nghệ An, tần suất xuất hiện Trichoderma của huyện Diễn Châu cao nhất 55,00%, huyện Quỳnh Lưu trung bình 49,50% và thấp nhất huyện Nghi Lộc 28,50% (bảng 3.4). Bảng 3.4. Tần suất xuất hiện nấm Trichoderma trên đất trồng lạc tại các điểm thu mẫu từ 2011-2013 STT Điạ điểm thu mâũ Số mẫu Số mẫu có Trichoderma Tần suất xuất hiện (%) 1 Nghê ̣An 600 266 44,30 Quỳnh Lưu 200 99 49,50 Diễn