Luận văn Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium Lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne SP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ MELOIDOGYNE SP. LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ MELOIDOGYNE SP. Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 1 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Phúc, Th.s Dương Đức Hiếu, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn này. Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn vi sinh đã giảng dạy, chỉ dẫn cho em trong suốt quá trình học tập. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị làm việc tạiviện Sinh học Nhiệt Đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài. Con xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã xin ra con nuôi nấng, dạy dỗ và luôn động viên con trong những lúc con gặp khó khăn. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khoá vi sinh vật 22 đã cùng em chia sẽ những khó khăn trong quá trình học tập. 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 1 MỤC LỤC .................................................................................................................... 2 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT ..................................................................................... 5 MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 6 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................ 6 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................... 6 3. Nhiệm vụ ......................................................................................................................... 7 4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................... 7 5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 7 6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7 7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 8 1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum ............................................... 8 1.1.1 Vị trí phân loại .......................................................................................................... 8 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu .................................................................................................. 9 1.1.3. Đặc điểm sinh học ................................................................................................... 9 1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum .................................................................. 10 1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng ở Việt Nam và trên thế giới ............................................................................................. 12 1.2. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ..................................................................... 13 1.2.1. Đặc trưng sinh học ................................................................................................ 13 1.2.2. Các loài quan trọng ............................................................................................... 15 1.2.3. Cơ sở phòng trừ tuyến trùng ................................................................................. 15 1. 3. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi ............................ 22 1.3.1. Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi ..................................................................... 22 1.3.2. Môi trường nuôi cấy .............................................................................................. 24 1.3.3. Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon ................................................................... 24 1.3.4. Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen ................................................................. 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 25 2. 1. Vật liệu ...................................................................................................................... 25 2. 2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................. 25 2. 3. Hóa chất .................................................................................................................... 25 3 2. 4. Môi trường ................................................................................................................ 26 2.4.1. Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường potato glucose agar-PGA ) .............................................................................................. 26 2.4.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth) 26 2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA) . 26 2. 5. Các phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 26 2.5.1. Phương pháp phân lập ........................................................................................... 26 2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng ......................................................... 27 2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi ......................................... 28 2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử ...................................... 28 2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng .................................................................. 29 2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng ............................................................................. 29 2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái ............................................ 30 2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro .................................................................................. 31 2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ........................................................... 32 2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov ................................................... 33 2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật............................................. 33 2.5.11. Các phương pháp khác ........................................................................................ 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 34 3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng ....................... 34 3.1.1. Phân lập ................................................................................................................. 34 3.1.2. Định danh .............................................................................................................. 34 3.2. Kết quả định danh tuyến trùng .............................................................................. 38 3.3. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. trong diều kiện in vitro ....................................................................................................................... 40 3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái loài Meloidogyne sp. trong điều kiện in vitro.............................................................................................................. 40 3.3.2 Kết quả thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây chuối ...................................................................................... 42 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ......................................................... 45 3.4.1 Ảnh hưởng của pH ................................................................................................. 45 3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ và nguồn Cacbon ....................................................... 49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 59 4 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 60 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 64 5 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT C: cacbon N: nitơ PGA: potato glucose agar 6 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp lâu đời. Hàng năm chúng ta cung ứng rất nhiều mặt hàng nông sản cho nhu cầu thương mại trong nước và còn xuất khẩu sang các nước. Các mặt hàng nông sản xuất khẩu tiêu biểu như: gạo, cà phê, cao su hay những mặt hàng nông sản trái cây với sản lượng lớn góp phần làm giàu cho nền kinh tế đất nước. Tuy nhiên, sản lượng nông sản thu hoạch hàng năm không ổn định có khi thất thoát. Nguyên nhân gây ra thực trạng trên có thể là do ảnh hưởng của khí hậu, thiên tai và đặc biệt là dịch bệnh. Dịch bệnh ở cây trồng do các tác nhân sinh học gây ra như: virut, nấm, tuyến trùng...thì trong số các đối tượng đó vấn đề bệnh do tuyến trùng gây ra chưa được nghiên cứu nhiều dẫn đến việc phòng bệnh gặp nhiều khó khăn. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ, tuy nhiên khi mật độ ký sinh lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng có thể gây chết thực vật. Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5 % sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng ký sinh đối với cây trồng nông nghiệp ước tính là hàng trăm tỷ USD mỗi năm. Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật đang phát triển, hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tiểu biểu như nhóm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. ký sinh ở rễ một số cây như cà phê, hồ tiêu, cà chua, cà rốt... gây ra những tổn thất đáng kể đặc biệt là những mặt hàng nông sản thế mạnh như cà phê, hồ tiêu. Để phòng trừ bệnh tuyến trùng rễ trên các đối tượng cây trồng trên có các biện pháp như: dùng các tác nhân cơ học, hoá học, sinh học...Trong số các biện pháp trên thì biện pháp phòng trừ tuyến trùng bằng các tác nhân sinh học như dùng các loại vi khuẩn Pasteuria penetrans, nấm (Nematoctonus concurrens và N. haptocladus, Purpureocillium lilacinum...) đang rất được quan tâm. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.”. 2. Mục tiêu của đề tài - Góp phần nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.bởi các tác nhân sinh học là nấm Purpureocillium lilacinum. 7 3. Nhiệm vụ - Phân lập nấm Purpureocillium lilacinum từ côn trùng bị bệnh. - Phân loại đến loài chủng nấm Purpureocillium lilacinum. - Phân loại đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp. - Thử nghiệm in vitro khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Purpureocillium lilacinum. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển sinh khối và hình thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum. 4. Đối tượng nghiên cứu - Chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ côn trùng bị bệnh. - Tuyến trùng Meloidogyne sp. phân lập từ đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng. 5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Công ty TNHH Gia Tường, chi nhánh số 7 đại lộ Độc Lập, khu công nghiệp Sóng Thần 1, huyện Dĩ An , tỉnh Bình Dương. Viện sinh học nhiệt đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP. 6, P. Linh Trung, Quận Thủ Đức, TP.HCM. Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2012 đến tháng 9/2013 6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu Góp phần tìm hiểu về đặc điểm sinh học,điều kiện nuôi cấy và khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. của Purpureocillium lilacinum. 7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu Trên cơ sở những kết quả thu được trong quá trình khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ chủng vi sinh Purpureocillium lilacinum từ đó ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm đặc trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. cho cây trồng. 8 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum 1.1.1 Vị trí phân loại − Giới (Kingdom) : Nấm − Ngành (Division): Ascomycota − Lớp (Class): Sordariomycetes − Bộ (Order): Hypocreales − Họ (Family): Ophiocordycipitaceae − Chi (Genus) : Purpureocillium (theo Luangsa-ard, Hywel-Jones, Houbraken & Samson (2011)) − Loài: Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Hou- braken, Hywel-Jones & Samson (2011) Tên đồng nghĩa: Paecillium Luangsa-ard, Hywel-Jones & Samson (2007); Penicillium lilacinum Thom (1910); Penicillium amethystinum Wehmer (1923) Spicaria rubidopurpurea Aoki (1941) Purpureocillium lilacinum (Thom) Samson (1974). Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi đơn loài có chứa loài duy nhất là Purpureocillium lilacinum, là loài nấm sợi hoại sinh phổ biến. Nó đựơc phân lập từ một loạt các môi trưòng sống bao gồm đất trồng và đất bỏ hoang, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông, bùn cặn nứơc thải và côn trùng. Nó cũng đã đựơc tìm thấy trong trứng giun tròn, tuyến trùng nang. Ngoài ra nó còn đựơc phát hiện thường xuyên trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng. Chúng có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng từ 8-38 oC, và nhiệt độ sinh trưỏng tối ưu trong khoảng 26-30 oC. Nó cũng có khả năng chịu đựng pH rộng 2-10 và có thể phát triển trên nhiều loại bề mặt khác nhau. Purpureocillium lilacinum đựơc cho là có tiềm năng sử dụng để kiểm soát sự phát triển của tuyến trùng rễ [16],[19]. 9 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu Các loài đựơc mô tả bởi nhà nấm học người Mỹ Charles Thom vào năm 1910 với tên gọi Penicillium lilacinum. Vào năm 1974 Charles Thom chuyển các loài này thành Paecilomyces. Những ấn phẩm trong thập niên 20 chỉ ra chi Paecilomyces không phải là đơn ngành mà có quan hệ mật thiết với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis and Nomuraea atypicola. Chi mới Purpureocillium được tạo ra để tổ chức các đơn vị phân loại. Tên gọi chung này đề cập đến các bào tử tím được tạo ra bởi nấm này. 1.1.3. Đặc điểm sinh học Purpureocillium lilacinum tạo thành một sợi nấm dầy đặc làm phát sinh cành bào tử phân sinh. Phần cuối của thể bình mang những bào tử được xếp thành chuỗi. Bào tử nảy mầm khi có độ ẩm và chất dinh dưỡng thích hợp. Khuẩn lạc trong môi trường thạch Malt phát triển nhanh, đạt đuờng kính 5-7cm trong vòng 14 ngày ở 15oC, bao gồm những sợi nấm khí sinh ban đầu có màu trắng nhưng khi hình thành bào tử thì có sự thay đổi sắc thái thành màu đỏ rượu vang. Sợi dinh dưỡng có thành bao trơn, trong suốt, kích thứơc 2.5-4 mm. Cuống sinh bào tử phát sinh từ sợi ký sinh hoặc phát sinh từ sợi nấm khí sinh. Cuống sinh bào tử dài khoảng 400-600 μm. Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu giống như một cái cổ. Bào tử trong chuỗi có nhiều hình dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn đến hơi nhám. Không có bào tử chống chịu [19]. 10 Hình 1.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên trái), cấu tạo vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên phải) [36] 1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum a. Tác nhân kiểm soát tuyến trùng Purpureocillium lilacinum là một loài nấm bông phổ biến với phạm vi phân bố rộng trên toàn thế giới (Samson, 1974) và đã được thử nghiệm rộng rãi nhất cho sự kiểm soát của bệnh sần rễ và u nang tuyến trùng. Purpureocillium lilacinum sử dụng chủ yếu trong điều kiện nhiệt đới, ví dụ như, ở Philippines (Jatala, 1986) và Cộng hòa Nam Phi (Neethling, 2002). Loài này có hiệu quả chống lại các loài tuyến trùng khác nhau gây bệnh thực vật, và chủ yếu lây nhiễm trứng và con cái tuyến trùng (Amancho và Sasser năm 1995; Borisov năm 1998; Pandey và Trivedi, 1990; Silva và cộng sự, 1992;. Sosnowska năm 2001; Zaki, 1994). Wang và cộng sự. (2001). Quan sát một số nhiễm trùng giai đoạn ấu trùng ở Đông Trung Quốc có sự khác biệt lớn trong khả năng gây bệnh giữa các chủng Purpureocillium lilacinum (Rodriguez- Kabana et al., 1984). Ở Ba Lan, một dòng nội địa của loại nấm này loài được nghiên cứu như một tác nhân sinh học tiềm năng chống lại tuyến trùng sần rễ trong nhà kính (Sosnowska, 2003). Hiện nay, Purpureocillium lilacinum là loài nấm chỉ có mục đích thương mại để kiểm soát tuyến trùng, sâu bệnh ở châu Âu, và chủng nấm 251 thương mại được đăng ký để bán ở một số nước (Atkins et al., 2005). Bởi vì nó được phân loại như một microbiopesticide [23]. Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng: Trứơc khi xâm nhiễm vào trứng tuyến trùng, Purpureocillium lilacinum áp sát vào bề mặt trứng và trở nên sát gần với trứng. Purpureocillium lilacinum sản xuất những tế bào chuyên biệt điển hình để lây nhiễm ở khắp nơi trên bề mặt trứng của tuyến trùng. Những tế bào chuyên biệt tương tự như những mấu lồi ở phần cuối của một sợi nấm giúp áp sát vỏ trứng. Sau khi sợi nấm xâm nhập vào vỏ trứng chúng nhanh chóng phá huỷ ấu trùng bên trong sau đó sợi nấm tạo thành cuống sinh bào tử ra phía ngoài xâm nhiễm các trứng liền kề [19]. 11 Hình 1.2: Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum [42] Hình 1.3: Trứng của tuyến trùng Meloidogyne javanica bị nhấn chìm bởi sợi nấm Purpureocillium lilacinum b. Sản xuất một số enzym Nhiều enzym đựơc sản xuất bởi Purpureocillium lilacinum đã đựơc nghiên cứu như: serine protease một loại enzym chống lại trứng của tuyến trùng Meloidogyne hapurpureocillium lilacinuma: protease và chitinase có thể làm suy yếu vỏ trứng của tuyến trùng [16],[19]. c. Kháng khuẩn Purpureocillium lilacinum khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins. Leucinostatins là một peptide trung tính với cấu trúc gồm: α-aminoisobutyric acid, L-leucine, β-alanine và theo sau bởi 3 acid amin bất thường (L-threo- β-hydroxy leucine, 2-amino-2-hydroxy-4-methyl-8 oxodecanoicacid và cis-4-methyl-L-proline (theo Mori et al. 1982).Leucinostatins có 6 loại đã được môt tả là A, B, C, D, E, F. Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến trùng không có sự tham gia của loại độc tố này [9]. 12 1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng ở Việt Nam và trên thế giới a. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thế giới Một số chế phẩm diệt tuyến trùng được sản xuất từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị trường thế giới Hình 1.4: Một số chế phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị trường thế giới [40] b. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum ở Việt Nam + Tuyến t