Luận văn Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------
---------- TRẦN THỊ THANH HẢO NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU vip3A LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn: 1. TS. CHU HOÀNG HÀ 2. GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn tốt nghiêp, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ vô cùng quý báu của Ban giám hiệu, Khoa Sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban lãnh ñạo Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội và tập thể Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin trân trọng cảm ơn Tiến sĩ Chu Hoàng Hà - Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu ñề tài và hoàn chỉnh luận văn. Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn và GS.TS Nguyễn Quang Thạch, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người luôn theo dõi và hướng dẫn chu ñáo ñể tôi hoàn thành bản luận văn này. Qua ñây, tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ phòng Sinh học Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, những người thân trong gia ñình và bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam ñoan Error! Bookmark not defined. Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined. Mục lục Error! Bookmark not defined. Danh mục các chữ viết tắt Error! Bookmark not defined. Danh mục bảng Error! Bookmark not defined. Danh mục hình Error! Bookmark not defined. 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá 3 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá 4 2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá 5 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại 6 2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá 7 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7 2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9 2.2.1 Khái niệm chuyển gen 9 2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10 2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt) 19 2.3.1 Lịch sử phát hiện ñộc tố Bt 19 2.3.2 Các loại protein ñộc tố của Bt 20 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới 22 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước 23 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25 3.1.1 Vật liệu 25 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25 3.2 ðịa ñiểm và thời gian: 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26 3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung ñiện 31 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 ) 31 3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 33 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi: 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A 37 4.1.1 Thiết kế mồi 38 4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39 4.1.3 Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40 4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40 4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp 41 4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42 4.2 Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45 4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens bằng xung ñiện 45 4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 46 4.3 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 53 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6 - benzyladenine bp Base pair = cặp bazơ Bt Bacillus thuringiensis Cefo Cefotaxime CNSH Công nghệ sinh học cry Crystal toxin gene = gen mã hóa protein nội ñộc tố δ cs Cộng sự CTTN Công thức thí nghiệm CV Coefficient of variation = sai số thí nghiệm DNA Deoxyribonucleic Acid EtBr Ethidium bromide GM Kan 30 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 30mg/l GM Kan 50 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l GM Môi trường tái sinh chồi gus β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IBA Indole-3-butyric acid Kan Kanamycin kb kilo base kDa kilo Dalton LB Môi trường theo Luria và Bertani LSD Least significant difference = sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) MT Môi trường OD Optical density = mật ñộ quang học PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase RM Môi trường ra rễ RM Kan 50 Môi trường ra rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l RNA Ribonucleic Acid TAE Tris bazơ - Axit acetic – EDTA T-DNA Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển TE Tris HCl - EDTA, pH = 8 Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u v/p Vòng/phút vip Vegetative insecticidal protein = gen mã hoá protein sinh dưỡng diệt côn trùng vir Virulence region = vùng gây ñộc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới giai ñoạn 2004 - 2008 8 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 9 4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A 38 4.2. Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn 49 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc Ti- Plasmit 12 2.2 Mô chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 14 4.1 Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 39 4.2 Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40 4.3 Kết quả ñiện di sản phẩm cắt plasmit 41 4.4 Sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI& SacI 43 4.5 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc hiệu V1.2/V2.2 44 4.6 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ hợp bằng enzyme BamHI & SacI 45 4.7 Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A trên môi truờng LB ñặc chọn lọc 48 4.8 Dịch huyền phù vi khuẩn 48 4.9 Mảnh lá CTTN trên MT GM Kan 30 50 4.10 Mảnh lá ð/C1 trên MT GM Kan 30 50 4.11 Mảnh lá ð/C2 trên MT GM 50 4.12 Cụm chồi CTTN trên MT GM Kan 50 50 4.13 Cụm chồi ð/C1 trên MT GM Kan 50 50 4.14 Cụm chồi ð/C2 trên MT GM 50 4.15 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 1) 51 4.16 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 2) 51 4.17 Cây ð/C trên MT RM Kan 50 51 4.18 Rễ cây chuyển gen trên môi trường RM Kan 50 51 4.19 Rễ cây ð/C trên môi trường RM Kan 50 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii 4.20 Cây trong bầu trấu cát 53 4.21 Cây trồng trong bầu ñất 53 4.22a Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp mồi 33S Fs/Rs 54 4.22b Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 6 dòng thuốc lá với cặp mồi 35S Fs/Rs 55 4.23 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng thuốc lá với cặp mồi V2.1/V2.3 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai ñoạn chế biến ñặc trưng (sấy, hong, phơi…) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá. Ngoài ra cây thuốc lá cũng ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng ñể chiết xuất dầu thực vật. Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau ñược quan tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một trong những hướng chọn tạo giống ñược quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) hoặc kháng sâu (sâu xanh, sâu xám...). Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội ñộc tố δ trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây các nhà khoa học ñã phát hiện các gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự và thử hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa. Gen vip3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có phổ hoạt ñộng rộng như diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12]. Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao [7]. Vấn ñề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một trong những hướng ñi ñể giải quyết vấn ñề ñó. Viện Công nghệ Sinh học ñã bước ñầu chuyển thành công gen kháng bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá dưa chuột CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào ñược công bố về sử dụng gen vip3A trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu. Trên cơ sở ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A” 1.2 Mục ñích và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu của ñề tài: Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A) 1.2.2 Nội dung nghiên cứu: - Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A. - Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumerfaciens. - Theo dõi, kiểm tra và ñánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ ñối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn ñiếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu ñến cả hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [16], [20]... Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0 - 5,5 triệu ha trải khắp từ 60o vĩ Bắc ñến 40o vĩ Nam và tổng sản lượng nguyên liệu thu ñược khoảng 6,5 - 8,5 triệu tấn (trong ñó khoảng 3,5 - 4,5 triệu tấn thuốc lá vàng; khoảng 0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là các loại khác ñể sản xuất khoảng 6.000 tỷ ñiếu hàng năm [22], [47]. Theo Reed S. M. [41] thì cây thuốc lá ñược phân loại thuộc giới thực vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có tới trên 85 chi với tổng số trên 1.800 loài. Một số loài trong họ này ñược trồng rộng rãi như khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong ñó có chi Nicotiana. ðặc trưng của các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin, atropin, scopalamin, nicotine... Chi Nicotiana ñược chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài trong ñó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1 loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại ñược trồng phổ biến làm thuốc lá là Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N. rustica. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 Loài N. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội (Dihaploid = 4n), có biến ñộng lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc ñóng lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc trên ñỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng ñến ñỏ (N. tabacum) hay màu vàng ñến vàng hơi xanh (N. rustica). Hoa thường tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn ñến 95%. Mỗi cây có thể cho 200 - 400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt. Trong hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu là Linoleic acid và Oleic acid), 20 - 30% protein. Trong 1 gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt có khả năng sống rất lâu [16], [20], [22]. 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá Trong lịch sử, cây thuốc lá ñược trồng ñầu tiên ở châu Mỹ từ hơn 6000 năm trước công nguyên và ñược sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm thuốc chữa bệnh [16], [22]. Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt ñới và Á nhiệt ñới, hương vị ñặc biệt của nó ñã ñược biết ñến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách ñây trên hai nghìn năm và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [16], [20]. Sử viết về cây thuốc lá bắt ñầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi Christopher Columbus ñặt chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn ðộ Dương. Các thổ dân ở ñó ñã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm quyến rũ khi chúng ñược châm hút ñể mời ñoàn thám hiểm [16], [20]. Người Tây Ban Nha bắt ñầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với nguồn hạt giống từ Mexico và sau ñó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hòn ñảo lân cận khác. Trồng trọt thuốc lá bắt ñầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau ñó phát triển sang Guiana, Brazil [20] và dần dần phát triển trên các châu lục khác. Một số tài liệu ñáng tin cậy cho rằng thuốc lá ñược trồng từ thời vua Lê Thần Tông (1660) bằng nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5 Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia ðịnh, tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá ñiếu bắt ñầu ñược sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này. Năm 1935, giống thuốc lá vàng sấy Blond cash ñầu tiên ñược du nhập và trồng thử ở An Khê, ñến năm 1940 trồng thử ở Tuyên Quang, Ninh Bình... [22]. 2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá 2.1.2.1. Rễ thuốc lá Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất ñịnh mọc ở cổ rễ, phần trên sát mặt ñất. Rễ trụ ñược hình thành từ phôi rễ. Rễ nhánh ñược phát sinh từ trục của rễ cái, thường có ñộ xiên 30 - 40o. Rễ hấp thu ñược phát triển trên các rễ nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây. Rễ bất ñịnh mọc từ thân, những rễ bất ñịnh ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi ñộ ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày ñặc ở lớp ñất 0 - 30 cm, phát triển theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin ñược vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá. 2.1.2.2 Thân cây Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân ñứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể ñạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều ñốt, mỗi ñốt mang một lá. ðường kính thân ñạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách. Có 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ. 2.1.2.3 Lá thuốc lá Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay ñổi tuỳ theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác. ðộ dày, màu sắc lá có thể thay ñổi. Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá bắt ñầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6 lá quyết ñịnh ñộ dày mỏng, ñộ ñàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có nhiều tuyến lông ña bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật. Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ. 2.1.2.4 Hoa Hoa thuốc lá là hoa ñơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị ñực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn, ñược hình thành do sự phân hoá của ñỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa. Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thể do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng,.. 2.1.2.5 Quả và hạt Quả thuốc lá ñược hình thành trên ñài hoa. Mỗi cây có 100 - 150 quả trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra. Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 ñến 15.000 hạt [14]. 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại Cây thuốc lá bị các loại bệnh hại chính là bệnh khảm lá thuốc lá do virus (TMV,CMV), bệnh xoăn lá thuốc lá do virus (TLCV), bệnh héo rũ vi khuẩn , ñen thân, héo ñốm cà chua.... Các loại sâu chính gây hại trên thuốc lá là sâu xanh (Helicoverpa assulta), sâu khoang (Prodenia litura), sâu xám (Agrotis ypsilon)... Ở Việt Nam, tuy chưa có số liệu chính xác nhưng nhiều chuyên gia cho rằng thiệt hại do bệnh và sâu ñối với thuốc lá khoảng 25 - 30%. Nếu sản lượng hàng năm là 30.000 tấn với giá bình quân 12.000 ñ/kg thì sâu bệnh hại ñã lấy ñi mất khoảng 100 tỷ ñồng/năm và mỗi phần trăm thu lại ñược từ phần thiệt hại này trị giá hàng tỷ ñồng [9]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7 2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thế giới. Ngoài ra thuốc lá còn ñược sử dụng vào một số mục ñích khác như: - Trồng nhóm Nicotiana rustica ñể chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ 4 - 5 % ñể sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin. - Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất ñược sclareol và 13 epi - sclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ ñậu. - Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược phẩm. - Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử dụng trong thực phẩm. - Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao. - Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá. - Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu ñã kết luận thuốc lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin. - Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cả Phomat Protein trong sữa [5]. 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 2.1.6.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá nguyên liệu của thế giới Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu ñược sản xuất ở các vùng từ 45o vĩ Bắc ñến 30o vĩ Nam. Diện tích trồng thuốc lá trên thế giới trong những năm gần ñây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55]. Trong tổng sản l