Luận văn Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesteron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --------------
-------------- NGUYỄN HẢI ðĂNG NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ðƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERON LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CHĂN NUÔI Mã số : 60.62.40 Người hướng dẫn khoa học : TS. ðỖ THỊ THẢO HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan các kết quả nghiên cứu của tôi trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, do tôi thực hiện và chưa sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Các trích dẫn trong luận văn ñược ghi rõ tên tài liệu trích dẫn, tác giả và nguồn gốc tài liệu ñó. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Tác giả Nguyễn Hải ðăng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN! Trong quá trình thực hiện ñề tài của luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của các thầy, cô giáo trong khoa Chăn nuôi- Thuỷ sản cùng toàn thể bạn bè, sự giúp ñỡ tận tình của tập thể cán bộ công nhân viên Phòng công nghệ tế bào ñộng vật - Viện công nghệ sinh học. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. ðỗ Thị Thảo và PGS. TS. ðỗ Khắc Hiếu, phòng Công nghệ tế bào ñộng vật - viện Công nghệ sinh học ñã tạo ñiều kiện, hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài này. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS -TS Nguyễn Bá Mùi, cán bộ giảng dạy bộ môn sinh hoá - sinh lí ñộng vật - Khoa Chăn nuôi - Thuỷ sản - Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã hướng dẫn và giúp ñỡ tôi tận tình ñể hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với gia ñình, bạn bè và những người thân ñã luôn thường xuyên chia sẻ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2008 Tác giả Nguyễn Hải ðăng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam ñoan...................................................................................................i Lời cảm ơn .................................................................................................... ii Mục lục ........................................................................................................ iii Danh mục các chữ vết tắt................................................................................v Danh mục các bảng .......................................................................................vi Danh mục các hình ..................................................................................... vii Danh mục các sơ ñồ .................................................................................. viii 1. MỞ ðẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài ...........................................................................1 1.2. Mục ñích của ñề tài là..............................................................................3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................... 4 2.1. Miễn dịch và ñáp ứng miễn dịch..............................................................4 2.2. Hiểu biết về hormon sinh dục- Progesteron ...........................................28 2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực ñề tài............33 3. ðÔI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 36 3.1. ðỐI TƯỢNG.........................................................................................36 3.2. NỘI DUNG ...........................................................................................37 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................37 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................. 43 4.1. ðánh giá kết quả gây ñáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA .....43 4.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng P3 - Al...................48 4.3. Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron .........51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 4.4. Gây báng cho chuột ...............................................................................59 4.5. Kiểm tra hiệu giá kháng thể ...................................................................59 5. KẾT LUẬN............................................................................................................. 63 5.1. KẾT LUẬN...........................................................................................63 5.2. ðỀ NGHỊ ..............................................................................................64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v DANH MỤC CÁC TƯ VIẾT TẮT P3- Al (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim)- Albumin. P3- BSA (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim) - BSA BSA (Bovine Serum Albumin) ATCC (American Type Culture Collection) DMEM (Dulbeco 7s Modified Eagles Medium) DMSO (Dimethyl Sulphoxide) EIA (Enzyme Immuno Assay) ELISA (Enzyme Linking Immuno Sorbent) FBS (Fetal Bovine Serum) FSH (Follicle Stimulating Hormone) FDA (Food and Drug Adminitration) GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone) HPRT (Hypoxanthin - Phospho - Ribosyl- Transferase) HAT (Hypoxanthin - aminopterin- thimidine) medium LH (Luteinizing Hormone) PBS (Photphate Buffered Saline) PEG (Polyethylen glycol) FCA (Freund complex Adjuvant) RIA (Radio immuno assay) CNSH (Công nghệ sinh học) ðƯMD (ðáp ứng miễn dịch) KN (Kháng nguyên) KTðD (Kháng thể ñơn dòng) PTL (Phân tử lượng) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 1. Kết quả ñáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm............................................ 44 2. Sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu Progesteron trong các mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây ñáp ứng miễn dịch với P3 – Al (n=5) .................... 47 3. Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp. ................. 50 4. Tỷ lệ giếng có kháng thể kháng progesteron trên tổng số giếng có tế bào lai .................................................................................................................................. 53 5. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng Progesteron trên 2 dòng tế bào. ................................................................................................ 54 6. Hiệu quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn ............................. 55 7: Giá trị OD của dịch nổi của các giếng dương tính kháng progesteron có 1 dòng tế bào............................................................................................................. 56 8. Tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng do 5 dòng tế bào tạo ra .................... 58 9. So sánh hiệu giá kháng thể của dịch nổi và dịch báng.................................... 60 10. Kết quả tinh sạch kháng thể ñơn dòng bằng (SAS) và Propur Kit. ................ 61 11. Kết quả kiểm tra huyết thanh thỏ thí nghiệm ................................................. 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii DANH MỤC CÁC HÌNH Số hình Tên hình Trang 1. Cấu trỳc ñiển hỡnh của khỏng thể ............................................................11 2. Bề mặt của khỏng thể IgG ........................................................................12 3. Sơ ñồ cỏc chuỗi của một khỏng thể. .........................................................12 4. Cỏc ñộc tố của vi khuẩn bờn cạnh một tế bào cơ thể. ...............................14 5. Cỏc ñộc tố trờn bị trung hoà bởi khỏng thể...............................................15 6. Khỏng thể ñơn dũng liờn kết với một epitope ñặc hiệu.............................19 6. Cụng thức cấu tạo của progesteron ...........................................................30 7. (A) Tế bào Sp2/0 ở ñộ phúng ñại 10ì20; (B) Tế bàoP3X ở ñộ phúng ñại 10ì20 .......................................................................................................49 8. (A) Tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder. (B) Tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder; .....................................................................................................51 9. (A) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá trình tách dòng; (B) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá trình tách dòng.........................................................................................53 10. Kiểm tra hiệu giá kháng thể ñơn dòng ở các ñộ pha loãng khác nhau; (A) Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần................................................60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ Số sơ ñồ Tên sơ ñồ Trang 1. Quy trình sản xuất kháng thể ñơn dòng.....................................................21 2a. Quá trình hình thành progesteron............................................................30 2b. Quá trình thái biến của progesteron ........................................................30 1 1. MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài Công nghệ sinh học là một bước tiến quan trọng trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên ñể nâng cao ñiều kiện sống của con người. Thế giới cùng nhau chia sẻ những kiến thức khoa học, thực hành và công nghệ. Bên cạnh những lĩnh vực ñang phát triển rất cao như: công nghiệp ñiện tử, công nghệ thông tin, chúng ta ñang chứng kiến sự gia tăng phát triển ngày càng lớn mạnh của công nghệ sinh học (CNSH). Có nhiều lĩnh vực CNSH khác nhau theo ñối tượng ứng dụng như CNSH phân tử, CNSH thực vật, CNSH ñộng vật…CNSH có ứng dụng rộng rãi trong y dược, lương thực, thực phẩm, năng lượng, hóa chất, vật liệu mới, nông lâm ngư nghiệp, bảo vệ môi sinh và ngày nay trong thể thao ñỉnh cao CNSH cũng ñược áp dụng một cách hiệu quả. Trong CNSH, tế bào ñược coi là ñối tượng trung tâm vô cùng quan trọng. Chúng có cấu trúc phức tạp và tinh vi, thực hiện quá trình trao ñổi chất như một nhà máy hóa học với nhiều ưu việt. Do tế bào có nhiều ưu thế nên CNSH ñã sử dụng tế bào làm nhà máy sản xuất và là công cụ thử nghiệm. CNSH tế bào người và ñộng vật có nhiều ứng dụng trực tiếp liên quan ñến con người nên phát triển rất nhanh, nó ñáp ứng nhiều nhu cầu cho phòng và chữa trị bệnh và nhiều ứng dụng trong nông nghiệp nhất là trong lĩnh vực chăn nuôi…ðặc biệt, trong thế kỉ XX ñã có 3 phát minh nền tảng của CNSH ñộng vật mà cả thế giới phải xôn xao và công nhận, ñó là kháng thể ñơn dòng, tế bào gốc, và nhân bản vô tính ñộng vật. Sự ra ñời của kháng thể ñơn dòng là một bước tiến quan trọng, ñặc biệt là trong chẩn ñoán và có triển vọng lớn trong sản xuất thuốc hướng mục tiêu. 2 Trong quá trình hội nhập kinh tế, phát triển ngành chăn nuôi là chiến lược trong phát triển ngành nông nghiệp nước ta. ðời sống người dân ngày càng ñược nâng cao, nhu cầu về các sản phẩm thịt, trứng, sữa tăng mạnh, do ñó công tác phát triển nhanh ñàn gia súc, gia cầm cần ñược quan tâm, chú trọng. Bên cạnh việc ứng dụng các kích dục tố ñể nâng cao khả năng sinh sản thì hướng nghiên cứu sử dụng kháng thể ñơn dòng ñể chẩn ñoán sớm có thai, phát hiện các rối loạn sinh sản ở con cái…có giá trị thực tiễn. Do trong thời gian ñầu của quá trình mang thai, bào thai còn quá nhỏ, toàn bộ cơ quan sinh dục còn biến ñổi chưa nhiều nên rất khó chẩn ñoán khi khám bằng phương pháp quan sát bên ngoài, sờ, nắn, gõ, nghe, khám qua trực tràng, khám qua âm ñạo…Mặt khác, còn có thể nhầm với triệu chứng một số bệnh ở cơ quan sinh dục nên càng khó khăn hơn. Ngoài ra, do mối liên quan giữa hệ thống màng nhung của nhau thai và niêm mạc tử cung chưa chặt chẽ nên dễ gây xảy thai. Progesteron là hormon sinh sản ñược tiết ra chủ yếu từ thể vàng buồng trứng và một phần do nhau thai. Hàm lượng progesteron có liên quan chặt chẽ ñến ñộng thái của quá trình sinh sản. Progesteron là hormon “chìa khóa" ñể thiết lập và duy trì một chu kì sinh sản bình thường của con cái. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ñịnh lượng progesteron trong huyết thanh, sữa và nước tiểu ñã cho kết quả trong ứng dụng chẩn ñoán có thai sớm và các bệnh sinh sản liên quan. Tuy nhiên, các phương pháp hóa lí ñòi hỏi nồng ñộ progesteron phải cao (mg/ml), tách chiết, tinh sạch phức tạp mới xác ñịnh ñược kết quả. Phương pháp ELISA sử dụng kháng thể ñơn dòng (monoclonal antibody) cho kết quả nhạy (µg/ml) không ñòi hỏi tách chiết và tinh sạch, ñộ chính xác cao hơn. Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: "Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng progesteron". 3 1.2 Mục ñích của ñề tài - Sản xuất ñược kháng thể ñơn dòng kháng progesteron có thể ñược sử dụng vào các mục ñích ñịnh lượng progesteron trong dịch sinh học (Huyết thanh, nước tiểu, nước bọt v.v.) 4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Miễn dịch và ñáp ứng miễn dịch Sinh vật luôn luôn bị ñe dọa bởi các tác nhân gây bệnh và các tác nhân có hại khác, do vậy phải có sự thích ứng ña dạng ñể bảo vệ mình. Miễn dịch là khả năng của cơ thể chống lại các kháng nguyên. Kháng nguyên (KN) là những chất lạ xâm nhập vào cơ thể như vi trùng, virus, chất ñộc… ðáp ứng miễn dịch (ðƯMD) là phản ứng của cơ thể nhận ra vật lạ và loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Có hai loại ðƯMD là: ðƯMD tự nhiên và ðƯMD thu ñược. 2.1.1. ðƯMD tự nhiên ðƯMD tự nhiên là ñặc tính không mắc phải một số bệnh của một số loài hay một số giống sinh vật nhất ñịnh ở lứa tuổi nhất ñịnh và có ngay khi cơ thể sinh ra, mang tính chất di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, không ñòi hỏi sự tiếp xúc mầm bệnh (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16]. Có hai loại ðƯMD tự nhiên: ðƯMD tự nhiên tuyệt ñối và ðƯMD tự nhiên tương ñối. a. ðƯMD tự nhiên tuyệt ñối ðây là ðƯMD mà trong bất cứ ñiều kiện nào, hoàn cảnh nào cũng không bị mất ñi, có thể tiêm vào cơ thể ñộng vật một lượng lớn mầm bệnh cũng không có khả năng gây bệnh, ví dụ: Bất cứ dưới ñiều kiện nào, bò không bao giờ mắc bệnh tị thư của ngựa, bệnh dịch tả lợn, ngựa không bao giờ mắc bệnh dịch tả trâu bò… b. ðƯMD tự nhiên tương ñối Là tính miễn dịch có thể thay ñổi khi chịu một sự tác ñộng nào ñó trong một ñiều kiện và thời gian nhất ñịnh như khi chịu tác dụng cao của ñộc lực vi sinh vật, hoặc thay ñổi nhiệt ñộ hay sức ñề kháng của cơ thể giảm … 5 Ví dụ: bình thường gà không bao giờ mắc bệnh nhiệt thán nhưng khi ngâm chân gà trong nước lạnh cho thân nhiệt giảm xuống rồi gây nhiễm vi khuẩn nhiệt thán thì gà bị bệnh. 2.1.2. ðƯMD thu ñược ðƯMD thu ñược có hai loại: ðƯMD thu ñược chủ ñộng và ðƯMD thu ñược bị ñộng. Trong ðƯMD thu ñược chủ ñộng, cơ thể tiếp nhận kháng nguyên và có thể tự tổng hợp ra kháng thể. Trong ðƯMD thu ñược bị ñộng, cơ thể ñược tiếp nhận trực tiếp kháng thể (ví dụ: tiêm truyền kháng thể hay kháng huyết thanh). a. Miễn dịch thu ñược chủ ñộng tự nhiên Là tính miễn dịch mà cơ thể có ñược sau khi mắc một số bệnh nhất ñịnh trong tự nhiên mà qua khỏi. Loại miễn dịch này có thể kéo dài rất lâu có khi suốt ñời. Ví dụ: Sau khi mắc bệnh ñậu mùa mà qua khỏi thì không bao giờ mắc lại nữa; hay nếu bị bệnh sởi mà qua khỏi thì không bao giờ mắc nữa. Ngoài ra trong quá trình sống của người và ñộng vật do tiếp xúc dần dần với vi sinh vật, mà không bị bệnh, nhưng nó ñã hình thành cho mình một khả năng miễn dịch với các bệnh do vi sinh vật ñó gây nên. Ví dụ miễn dịch hình thành ñối với bệnh bạch cầu, bệnh ho gà. b. Miễn dịch thu ñược chủ ñộng nhân tạo Là miễn dịch có ñược của cơ thể sau khi ñược tiếp nhận chủ ñộng những chế phẩm vi sinh vật như các vacxin, giải ñộc tố… lúc này cơ thể ñã huy ñộng các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch sản xuất ra các yếu tố chống lại mầm bệnh nếu chúng vào lần sau, ñó là các kháng thể ñặc hiệu. ðây là loại miễn dịch hình thành với mục ñích làm cho cơ thể tập dượt trước, ñể khi vi sinh vật có ñộc lực xâm nhập vào thì cơ thể sẽ chủ ñộng loại trừ chúng. Chính ñây là cơ sở cho việc tiêm phòng vacxin: Lao, Dịch tả lợn, ðóng dấu lợn…Tiêm 6 phòng vacxin chính là tạo miễn dịch thu ñươc chủ ñộng nhân tạo cho cơ thể (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16]. Tiêm vacxin giúp cơ thể tăng khả năng bảo vệ mình trước tác hại của mầm bệnh. Nhưng ñứng về phương diện miễn dịch thì miễn dịch chủ ñộng phần nhiều là miễn dịch tương ñối vì nó có thể bị mất ñi sau một thời gian hoặc bị phá hoại nếu ta tiêm vào cơ thể một lượng lớn vi sinh vật, ñiều này ñòi hỏi khi tiêm phòng một số bệnh phải chú ý tiêm ñịnh kỳ. c. Miễn dịch thu ñược bị ñộng tự nhiên Trẻ sơ sinh, gia súc non thu ñược các yếu tố miễn dịch, các kháng thể ñặc hiệu từ cơ thể mẹ truyền sang qua nhau thai hay kháng thể truyền qua sữa ñầu cho gia súc non ñược gọi là MDTð bị ñộng tự nhiên. d. Miễn dịch thu ñược bị ñộng nhân tạo Là ñáp ứng miễn dịch thu ñược từ bên ngoài ñưa vào giúp cơ thể chiến thắng ñược bệnh tật. Trong trường hợp này, cơ thể không tham gia tạo kháng thể mà kháng thể ñược cung cấp cho cơ thể từ bên ngoài. MDTð bị ñộng nhân tạo ứng dụng trong chữa bệnh. Ví dụ: tiêm giải ñộc tố uốn ván cho người nhiễm uốn ván, tiêm kháng huyết thanh phòng dại… 2.1.3. Các cơ quan và tế bào tham gia vào ñáp ứng miễn dịch Thực chất của quá trình ðƯMD là hoạt ñộng của hai loại tế bào lympho B và lympho T với sự tham gia của ñại thực bào và sự phối hợp ñiều khiển của các cơ quan dạng lympho. 2.1.3.1. Các cơ quan dạng lympho Các cơ quan dạng lympho trung tâm là nơi mà quá trình biệt hóa của lympho bào xảy ra không cần ñến sự kích thích của kháng nguyên, ñó là nơi biệt hoá của các tế bào nguồn thành các tế bào lympho T chín hoặc lympho B chín. Các cơ quan dạng lympho gồm có: 7 *Tủy xương (Bone narrow): là cơ quan tạo máu của cơ thể ñóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất ra các tế bào nguồn của các dòng lympho bào khác nhau và của ñại thực bào. Các tế bào lympho nguồn (non) sẽ ñi ñến các cơ quan lympho khác ñể biệt hóa thành tế bào lympho B hoặc lympho T. *Tuyến ức (Thymus): nằm ngay sát sau xương ức, xuất hiện ở tháng thứ ba của thời kì bào thai, hoàn thiện và ñạt tối ña về hoạt ñộng ở giai ñoạn trước tuổi dậy thì. Tuyến ức có các nang làm nhiệm vụ sản xuất các tế bào lympho. Các tế bào lympho ñược sinh ra từ tuyến ức hay từ tủy xương di tản xuống ñều ñược tuyến ức huấn luyện, biệt hóa trở thành tế bào lympho phụ thuộc tuyến ức hay còn gọi là lympho T (Thymus). *Túi Fabricius (Brusa Fabricius) Túi này chỉ có ở loài chim, nằm phía trên trực tràng, sát lỗ huyệt. Túi có cấu tạo gồm rất nhiều nang, các nang này là nơi sản xuất các tế bào lympho. Các tế bào lympho một phần do túi Fabricius tiết ra, một phần di tản từ tủy xương ñến, ñều ñược tập trung tại ñây ñể huấn luyện, biệt hóa trở thành tế bào lympho B chịu trách nhiệm ñáp ứng miễn dịch dịch thể hay còn gọi là tế bào không phụ thuộc tuyến ức. Ở người và ñộng vật có vú, (cá, bò sát…) không có túi fabricius, mọi chức năng của túi fabricius do các cơ quan tương ñương ñảm nhận, ñó là tủy xương và các cơ quan lympho ngoại vi (hạch, lá lách…). Sau khi trở thành lympho B, các tế bào này ñến các cơ quan như lá lách , hạch … ñể ñón ñợ