Luận văn Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------------- Nguyễn Thị Hương NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2010 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương i Cao học K16 Sinh học LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Nguyễn Mộng Hùng nguyên Trưởng phòng Công nghệ tế bào Động vật – Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Thầy là người đầu tiên đã thu nhận và hướng dẫn tôi khi tôi bắt đầu tiến hành luận văn cao học này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Lai Thành, Chủ nhiệm bộ môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Thầy là người trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt khóa học. Thầy đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn cao học này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đào Đức Thà và Ths. Nguyễn Thị Thoa, Ths. Lưu Ngọc Anh cùng các đồng nghiệp phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phạm Việt Quỳnh cùng các em Phòng Công nghệ Tế bào Động vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội và đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình tôi, những người đã luôn ủng hộ và là nguồn động viên lớn lao giúp tôi có thể hoàn thành khóa học này. Hà Nội tháng 11/2010 Học viên Nguyễn Thị Hương Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương ii Cao học K16 Sinh học DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AMP: Adenosine monophosphate BSA: Bovine serum albumin ( Albumin huyết thanh bò) DMSO: Demethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic) eCG: equine chorionic gonadotropin (Huyết thanh thai ngựa) FCS: Fetal calf serum (Huyết thanh bê) FSH: Follicle stimulating hormone (Hóc môn kích thích nang trứng) GV: Germinal vesicle (Túi mầm) hCG: Human chorionic gonadotropin (Chorionic gonadotropin người) ICM: Inner cells mass ( Nút phôi) ICSI: Intracytoplasmic sperm injection IVF: In vitro fertilization (Thụ tinh ống nghiệm) IVM: In vitro maturation (Nuôi thành thục trong ống nghiệm) IVC: In vitro culture (Nuôi cấy ống nghiệm) LH: Luteinizing hormone (hóc môn gây rụng trứng) NCSU: North Carolina State University PBS: Phosphate buffer solution (Dung dịch đệm phot phat) PFF: Porcine follicular fluid (Dịch nang trứng lợn) SOD: Superoxide dismutase TTON: Thụ tinh trong ống nghiệm ZP: Zona pellucida (Màng sáng) TCN: Tiêu chuẩn nuôi Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương iii Cao học K16 Sinh học MỤC LỤC Trang DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT _____________________________________ ii MỤC LỤC ___________________________________________________ iii MỤC LỤC HÌNH ______________________________________________ v MỞ ĐẦU _____________________________________________________ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ________________________________________ 3 1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng _________________________________ 3 1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng ________________________ 3 1.1.2 Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng ________________________ 6 1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng ______________________ 11 1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng ___________ 13 1.3.1 Cấu tạo tinh trùng ______________________________________ 13 1.3.2 Quá trình sinh tinh ______________________________________ 14 1.4 Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi trường ____________________________________________ 15 1.4.1 Sự thành thục của tế bào trứng _____________________________ 16 1.4.2 Vai trò của tế bào nang __________________________________ 17 1.4.3 Vai trò của việc bổ sung dịch nang trứng và FCS trong môi trường nuôi thành thục trứng ________________________________________ 18 1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng _____________________________________ 20 1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng _____________________________ 20 1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro _____________________________ 21 1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng ________ 22 1.6 Thụ tinh trong ống nghiệm _________________________________ 24 1.6.1 Sự thụ tinh ____________________________________________ 24 1.6.2 Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm ________________________ 24 1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm ______ 25 1.7 Nuôi phôi trong ống nghiệm ________________________________ 26 1.7.1 Quá trình phát triển phôi _________________________________ 26 1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh __________________________ 28 1.8 Cất giữ lạnh phôi _________________________________________ 29 1.9 Giải đông phôi ___________________________________________ 32 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương iv Cao học K16 Sinh học Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ________ 33 2.1 Đối tượng _______________________________________________ 33 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất _________________________________ 33 2.2.1 Thiết bị ______________________________________________ 33 2.2.2 Hóa chất _____________________________________________ 33 2.2.3 Dụng cụ, vật tư tiêu hao __________________________________ 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu ___________________________________ 35 2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản buồng trứng từ lò mổ ____________ 35 2.3.2 Phương pháp thu trứng từ buồng trứng ______________________ 35 2.3.3 Phương pháp thu dịch nang trứng __________________________ 36 2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng thu được ______________ 36 2.3.5 Phương pháp nuôi tế bào trứng chín in vitro __________________ 37 2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng ______________________ 37 2.3.7 Phương pháp hoạt hóa tinh trùng in vitro _____________________ 38 2.3.8 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm _____________________ 38 2.3.9 Phương pháp nuôi hợp tử trong ống nghiệm __________________ 39 2.3.10 Phương pháp đánh giá chất lượng phôi _____________________ 40 2.3.11 Phương pháp bảo quản lạnh phôi __________________________ 40 2.3.12 Phương pháp giải đông phôi và nuôi cấy phôi sau giải đông _____ 42 2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu _______________________________ 43 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ___________________________ 44 3.1 Kết quả thu buồng trứng và tế bào trứng ______________________ 44 3.2 Kết quả đánh giá, phân loại trứng trước khi nuôi cấy in vitro _____ 46 3.3 Kết quả nuôi trứng thành thục ______________________________ 49 3.4 Kết quả thụ tinh và tạo phôi ________________________________ 52 3.4.1 Kết quả thụ tinh của trứng sau khi nuôi in vitro ________________ 52 3.4.2 Kết quả tạo phôi từ trứng sau khi nuôi và thụ tinh in vitro ________ 53 3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh ____________________________ 56 3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh ___________________________ 56 3.5.2 Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông ______________________ 57 3.6 Kết quả thu dịch nang trứng ________________________________ 60 KẾT LUẬN __________________________________________________ 62 KIẾN NGHỊ __________________________________________________ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO _______________________________________ 64 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương v Cao học K16 Sinh học MỤC LỤC HÌNH Trang Hình 1: Sơ đồ sự phát triển của nang trứng ........................................................... 4 Hình 2: Cấu tạo bên trong nang Graaf ................................................................... 5 Hình 3. Tế bào trứng lợn thành thục ...................................................................... 7 Hình 4. Quá trình hình thành giao tử cái ................................................................ 9 Hình 5. Cấu tạo ống dẫn trứng ............................................................................. 11 Hình 6. Sơ đồ quá trình hình thành giao tử đực ................................................... 14 Hình 7. Trứng đang trong quá trình thành thục nhân ........................................... 16 Hình 8: Mối liên hệ giữa tốc độ làm lạnh và sự hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào .............................................................................................................. 30 Hình 9. Mô hình cọng rạ sử dụng để cất giữ phôi đông lạnh ............................... 41 Hình 10. Chương trình chạy máy đông lạnh phôi lợn ......................................... 42 Hình 11: Các bước giải đông phôi ....................................................................... 43 Hình 12: Tiến hành thu trứng và dịch nang trứng ................................................ 44 Hình 13: Hình ảnh phân loại trứng trước khi nuôi in vitro .................................. 47 Hình 14: Trứng sau khi nuôi in vitro ................................................................... 51 Hình 15: Hình ảnh phôi lợn tại thời điểm thu hoạch phôi sau khi nuôi ............... 54 Hình 16: Hình ảnh phôi khi phân loại trước đông lạnh ....................................... 57 Hình 17: Hình ảnh phôi sau giải đông ................................................................. 58 Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương 1 Cao học K16 Sinh học MỞ ĐẦU Trong suốt quá trình phát triển, loài người đã khai phá thiên nhiên, thuần hóa và chọn lọc rất nhiều loại động vật, giữ lại những giống loài tốt, có lợi cho mình và loại thải những giống không hiệu quả. Trong các loài động vật được thuần hóa, lợn là loài động vật gắn bó với con người từ thuở hoang sơ cho tới tận bây giờ. Điều này đã nói lên sự cần thiết và vai trò to lớn của lợn trong đời sống con người. Vai trò đầu tiên phải kể đến của lợn đó là nguồn thực phẩm cần thiết, có giá trị dinh dưỡng cao cho con người. Theo Harris và cs (1956) thì cứ 100g thịt lợn nạc có 367 Kcal và 22 g protein [18]. Trong xã hội hiện đại, lợn còn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong nghiên cứu khoa học. Theo các nhà nghiên cứu giải phẫu và mô học thì cấu tạo phôi thai của lợn và người có sự tương đồng rất lớn [3]. Do đó các nhà nghiên cứu đã sử dụng phôi thai lợn để tiến hành nghiên cứu về cấu tạo, sự phát triển và các cơ chế hoạt động của phôi thai người. Còn theo các nhà dinh dưỡng học thì nhu cầu dinh dưỡng và tỷ lệ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của lợn rất gần với con người. Vì vậy mà lợn đã được sử dụng làm đối tượng để tiến hành các thí nghiệm về dinh dưỡng cho con người. Cùng với sự phát triển của khoa học thì lợn càng giữ nhiều vai trò quan trọng trong việc phục vụ sức khỏe con người. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng công nghệ cấy ghép, chuyển gen để cải thiện sức kháng bệnh tật, thay đổi đặc tính sinh trưởng, sử dụng lợn như một bộ máy sinh học để tạo ra nguồn dược liệu quí. Đặc biệt trong y học, các nhà khoa học đã tạo ra mô hình trên lợn nhiều loại bệnh khác nhau của người bằng cách đưa gen gây bệnh của người vào hệ gen của lợn. Mặt khác, cũng bằng cách này, các nhà khoa học còn cố gắng tạo ra cho các bộ phận để chuyển những con lợn chuyển gen của người với khả năng tương đồng cao về mặt miễn dịch nhằm mục đích cấy ghép các cơ quan cho người bệnh. Kỹ thuật tạo phôi lợn kết hợp với cấy truyền phôi lợn là những kỹ thuật bắt buộc cần có để Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương 2 Cao học K16 Sinh học điều đó trở thành hiện thực. Vì các lý do này mà việc nghiên cứu phôi và tạo phôi lợn in vitro đã được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới. Xét trên phương diện công nghệ sinh học và chăn nuôi, kỹ thuật tạo phôi lợn in vitro là kỹ thuật quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi bằng cách tạo ra số lượng phôi lớn có chất lượng tốt và khả năng sống cao. Ngoài ra, trứng sau khi nuôi thành thục còn có thể phục vụ cho nhiều nghiên cứu cơ bản khác như: ICSI, cloning, chuyển gen, đông lạnh phôi lợn để bảo tồn các giống quí hiếm, những cá thể giống tốt trong ngân hàng gen [42], [43], [71]. So với việc tạo phôi lợn bằng phương pháp in vivo thì việc tạo phôi lợn bằng phương pháp in vitro có một số ưu điểm vượt trội. Đó là phương pháp này giảm thiểu việc sử dụng lợn mẹ trong các thí nghiệm vì có thể sử dụng các buồng trứng được thu từ các lò mổ với số lượng rất lớn. Cùng với đó, số lượng trứng thu được đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm cũng rất nhiều vì vậy chi phí để tạo phôi bằng phương pháp này sẽ giảm đi đáng kể. Ngoài ra, trước thực tế một số giống lợn quí hiếm của nước ta đang nằm trước nguy cơ tuyệt chủng thì nhiệm vụ bảo vệ đa dạng sinh học các giống lợn là rất cần thiết. Viện Chăn nuôi đã thực hiện bảo tồn bằng phương pháp in situ nhưng phương pháp này rất tốn kém không an toàn so với phương pháp bảo tồn giống lợn bằng phôi đông lạnh. Với những mục đích như trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm” của chúng tôi đặt ra ba nội dung để giải quyết là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro từ trứng lợn thu từ lò mổ; Thử nghiệm cải thiện chất lượng phôi lợn bằng cách bổ sung dịch nang buồng trứng lợn vào môi trường nuôi thành thục trứng; Thử nghiệm bảo quản phôi lợn thụ tinh in vitro bằng đông lạnh trong ni tơ lỏng. Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương 3 Cao học K16 Sinh học Chương 1. TỔNG QUAN 1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng 1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng Buồng trứng là cơ quan tạo giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) ở động vật nói chung cũng như ở các gia súc nói riêng. Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu. Buồng trứng ở mỗi con cái gồm một buồng trứng bên trái và một buồng trứng bên phải. Chức năng của buồng trứng là: tạo ra tế bào trứng và sản xuất hormone sinh dục cái [33]. Buồng trứng tạo trứng thành thục theo một tần suất nhất định. Ở lợn, mỗi chu kỳ rụng trứng tạo ra khoảng 10-20 tế bào trứng mỗi. Tế bào trứng nằm trong các nang trứng. Các hormone được buồng trứng tiết ra là estrogen và progesterone. Estrogen được tiết ra từ các nang trứng còn progesterone được tiết ra từ các thể vàng, cả hai hormone này đều thuộc nhóm hormone steroid. Estrogen có chức năng: kích thích sự phát triển của các cơ quan sinh dục cái; tăng hành vi liên quan đến động dục như chịu đực; kích thích sự phát triển của tuyến vú; kích thích các đặc tính sinh dục của lợn nái. Progesterone có vai trò quan trọng trong việc chuẩn bị tử cung để cho phôi làm tổ; ngăn cản sự thành thục của các tế bào trứng khác trong quá trình mang thai; duy trì sự có chửa và kết hợp với estrogen và các chất khác để kích thích sự phát triển của tuyến vú. Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài. Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone. Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt. Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập phương bao phủ toàn bộ bề mặt của buồng trứng. Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết, gọi là áo trắng buồng trứng. Phía dưới áo trắng buồng trứng là nhu mô, được coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng. Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương 4 Cao học K16 Sinh học Người ta cho rằng tất cả nang nguyên thủy (primordial follice) được hình thành trước khi con con vật cái được sinh ra. Số lượng lớn nhất được tìm thấy ở bào thai lợn từ ngày 50-90 sau khi thụ thai. Nang nguyên thủy là một tế bào sinh dục được bao quanh bởi một lớp nang tế bào dẹt có cấu trúc dạng biểu mô. Chúng nằm trong nhu mô và thường quan sát được theo nhóm gọi là ổ trứng (egg nest) [55] Hình 1: Sơ đồ sự phát triển của nang trứng Trong buồng trứng ở cá thể đã thành thục thường xuyên có các nang trứng ở trạng thái phát triển và thành thục. Giải phẫu miền vỏ của một gia súc cái có hoạt động sinh sản sẽ cho thấy các giai đoạn thành thục này (Hình 1). Ngoài các nang trứng nguyên thủy còn có các nang trứng sơ cấp hay còn gọi là nang bậc 1. Đây là những nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầu biến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật. Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển. Khi số lượng tế bào hạt tăng thành 2 rồi thành nhiều lớp thì nang trứng giai đoạn này được gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle). Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành các xoang giữa Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương 5 Cao học K16 Sinh học các nang bào. Các xoang nhỏ lớn dần cùng sự phát triển của trứng và sau đó thì kết hợp làm một. Khi một xoang đã được hình thành thì nang đó được gọi là nang bậc III (tertiary follicle) hay còn gọi là nang có hốc. Nang bậc III thành thục khi quan sát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng và được gọi là nang Graaf. Dịch trong nang bậc III được gọi là dịch nang trứng. Đây là một dịch nhớt giàu hormone sinh sản steroid. Nhiều hormone sinh sản khác cũng như các yếu tố không phải hormone giúp điều hoà chức năng buồng trứng cũng đã được tìm thấy trong dịch nang trứng. Hình 2: Cấu tạo bên trong nang Graaf Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năng quan trọng (Hình 2). Bao Graaf thường có kích thước rất lớn, ở lợn đường kính bao Graaf trước khi vỡ vào khoảng 8-12 mm, nó đội cả màng trắng và biểu mô phủ buồng trứng lồi hẳn lên trên mặt buồng trứng. Bao Graaf là một cái xoang chứa dịch với rất nhiều enzym, hormon, AMP vòng và các phân tử khác, các nang bào bị đẩy ra ngoại vi, hình thành một lớp bọc xoang dày khoảng 5-6 lớp tế bào hạt. Noãn bào có vài lớp nang bào bao quanh được gọi là vành phóng xạ sẽ bao quanh trứng khi trứng rụng và cả khi trứng di chuyển trong ống dẫn trứng. Khối gồm noãn bào và vành phóng xạ lúc này bị đẩy về một phía của xoang và chỉ nối với thành nang bởi một dải vài lớp tế bào gọi là cuống mang trứng, đặc điểm này Luận văn Thạc sỹ Khoa Sinh học Nguyễn Thị Hương 6 Cao học K16 Sinh học tạo thuận lợi cho sự tách noãn khỏi thành nang trứng. Màng sáng lúc này đã rất dày và rõ. Noãn bào cực đại tuy có kích thước rất nhỏ so với nang trứng (khoảng 150 m so với 15-20mm). Nhân noãn bào rất lớn còn gọi là bóng phôi, nó có thể nằm ở giữa noãn bào hay lệch về một phía hoặc sát với màng tế bào. Vỏ nang trứng gồm 2 lớp cũng rất rõ và dày. Trước khi trứng rụng một vài giờ, nhân noãn bào di chuyển tới sát màng nhân và tiếp tục lần phân chia giảm nhiễm và kết thúc trước khi trứng rụng. Kết quả của lần phân chia này là từ noãn bào 1 cho ra 2 tế bào con đơn bội (n kép) đồng đều về số nhiễm sắc thể nhưng lại không chia đều tế bào chất. Một tế bào chiếm gần như toàn bộ tế bào chất trở thành noãn bào 2 có tác dụng sinh dục. Một tế bào nhỏ chỉ có rất ít tế bào chất không có tác dụng sinh dục gọi là thể cực 1. Cả hai tế bào đều nằm bên trong màng sáng. Quá trình biến đổi của nang trứng đã làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng 500 lần, kích thước noãn bào cũng tăng lên nhưng không nhiều như nang trứng, ở người nó tăng từ 10m ở nang nguyên thuỷ lên 80m ở bao Graaf. Dấu hiệu trước khi rụng trứng là xuất hiện một vùng màu nhạt ở cực nang trứng phần lồi lên mặt buồng trứng do sự ngừng lưu thông máu cho các mao mạch nằm ở lớp vỏ trong của nang trứ