Luận văn Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu của tôi. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008 Tác giả Bùi Thị Hà MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN..................................................................3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên............................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn..................................................4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn...............................................5 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn....................................................................6 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI... ...........8 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy.....................................8 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)..................................9 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................10 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)............................................10 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces..........................................11 1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN.................................................12 1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh...........................................12 1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn..................................15 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh........16 1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT..................................................18 1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm......................................................18 1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật.................................21 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất.........................................................................24 2.1.1. Nguyên liệu................................................................................24 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.................. ...................................24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................27 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè...........................27 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn..........................................................28 2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski........................................28 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh ................................................28 2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh............29 2.2.3. Bảo quản giống......................................................................................29 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn....................30 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái...................................................................30 2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy....................................................................31 2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa......................................................31 2.2.5. Lên men tạo kháng sinh.........................................................................32 2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp .................................32 2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon..................................................33 2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ......................................................33 2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA....33 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB.....................33 2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR...................34 2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose......................................35 2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu.....................................................................36 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè......................37 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn.............................................................38 3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn............................38 3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao..........................41 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2....42 3.3.1. Đặc điểm hình thái......................................................................42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy........................................................................43 3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................45 * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon...............................................45 * Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp .........................................................46 * Khả năng chịu muối...........................................................................46 * Khả năng sinh enzym ngoại bào........................................................47 3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1..............................48 3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1....................50 3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn...........52 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp.....................................52 3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon.....................................................54 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ..........................................................56 3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử........57 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn..........57 3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR..................58 Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận.........................................................................................60 4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo.....................................61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN....................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................63 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN XK : Xạ khuẩn VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KTKS : Khuẩn ty khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKN : Hoạt tính kháng nấm MT : Môi trƣờng KHVQH : Kính hiển vi quang học KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm.....37 Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu................................39 Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè.......40 Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn..................................41 Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1.........................................44 Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2....45 Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1...................46 Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1...................................47 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định.........................................................................................................48 Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis....50 Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng lên men khác nhau...........................................................................................53 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1.....................................................................................55 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1...............................................................................................56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh.............................38 Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu.................39 Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm.........................40 Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn.....................42 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2................................42 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1...............................43 Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng...........................44 Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn.......................................47 Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2....49 Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS ............54 Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS.........55 Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS.............57 Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn.........................58 Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.....59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -1- MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh. Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững. Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -2- 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè. - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên. - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. * Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV kiểm định. 2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ các mẫu đất khác nhau. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -3- Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [43]. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm. Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -4- amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [7]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22]. Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ quan sát bằng mắt thường. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -5- * Khuẩn ty Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng. Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 m/giờ [43] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi. Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy sợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên trong chứa các bào tử nang [7]. 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -6- Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A 0