Luận văn Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Sinh viên thực hiện ĐẶNG THỊ THU THẢO MSSV: 0753040084 LỚP: ĐH NTTS K2 Cần Thơ, 2011 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện PGs.Ts. NGUYỄN VĂN BÁ ĐẶNG THỊ THU THẢO ThS. NGUYỄN THÀNH TÂM 2011 3 XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Luận văn kèm theo đây với tựa đề: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men”. Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực hiện và báo cáo đã được Hội đồng chấm luận văn thông qua. Phản biện Ủy viên Cần Thơ, ngày 13 tháng 07 năm 2011 Chủ tịch hội đồng 4 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và sinh hoạt. Cảm ơn quý Thầy Cô Khoa Sinh Học Ứng Dụng đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ những ngày đầu bước chân vào trường đến nay. Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men” được kết thúc thành công. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Thầy Nguyễn Văn Bá đã hỗ trợ môi trường nuôi cấy và các dụng cụ đặc trưng cho thí nghiệm, Thầy Nguyễn Thành Tâm luôn theo sát hướng dẫn đề tài và cung cấp một số tài liệu liên quan. Cảm ơn Cô Trần Ngọc Huyền – cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để đề tài kết thúc đúng thời hạn và xin cảm ơn anh Lê Văn Toàn (lớp ĐH NTTS K2) cùng hai em Nguyễn Thị Thùy Trang và Dương Thị Bé Ba (lớp ĐH NTTS K3) đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện. Cảm ơn Thầy cố vấn học tập Tạ Văn Phương , Thầy Nguyễn Lê Hoài Phương (Khoa cơ bản) và các thành viên lớp ĐH NTTS K2 đã sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Chân thành cảm ơn! Đặng Thị Thu Thảo 5 TÓM TẮT Vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men thực phẩm. Chúng sinh ra nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H2O2 và chất kháng khuẩn. Do đó, việc tìm ra những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn lactic nhằm bổ sung cho những nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng dụng chất kháng khuẩn vào trong nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu sử dụng môi trường MRS để phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp trực tiếp để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus. Kết quả cho thấy có tổng số 83 dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ 37 mẫu mắm và nước mắm (thu ngẫu nhiên ở những chợ thuộc vùng nước ngọt và nước lợ mặn) và có 19 dòng cho vòng kháng khuẩn đối với dòng chỉ thị. Độ dày vòng kháng khuẩn từ 0,1 – 0,85 cm, trong đó có 9 dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn 0,1 cm là nhỏ nhất. Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men thủy sản để kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus. Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Chất kháng khuẩn, Phương pháp trực tiếp, Pediococcus pentosakeus. 6 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................... i TÓM TẮT........................................................................................................................ ii MỤC LỤC....................................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH...................................................................................................... vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................................... vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu .................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU....................................................................... 3 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản.............................................................................. 3 2.2 Vi khuẩn lactic ............................................................................................................ 7 2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men axit lactic ......................................................... 7 2.2.2 Cơ chế của quá trinh lên men axit lactic ............................................................. 8 2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá .......................................... 8 2.4 Chất kháng khuẩn ....................................................................................................... 9 2.5 Dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus..................................................................... 12 2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước.................................................................... 13 2.6.1 Những nghiên cứu trong nước ......................................................................... 13 2.6.2 Những nghiên cứu ngoài nước......................................................................... 14 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 15 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện................................................................................ 15 3.1.1 Địa điểm........................................................................................................... 15 3.1.2 Thời gian thực hiện .......................................................................................... 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 17 3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu .................................................................. 17 3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm ....................................................... 18 3.4 Phân tích và xử lý số liệu.......................................................................................... 20 3.4.1 Phân tích VKL ................................................................................................. 20 3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn ..................................................................... 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 21 4.1 Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men................................ 21 4.1.1 Thu mẫu ........................................................................................................... 21 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1......................................................................................... 21 4.1.3 Cấy ria trên đĩa pêtri ........................................................................................ 23 7 4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram .......................................................................... 25 4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 2......................................................................................... 26 4.1.6 Lưu trữ mẫu ..................................................................................................... 26 4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được........................................ 26 4.2.1 Tối ưu hóa quy trình ........................................................................................ 26 4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được ...................................... 27 CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT............................................................................ 31 5.1 Kết quả ...................................................................................................................... 31 5.2 Đề xuất ...................................................................................................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 32 PHỤ LỤC A.................................................................................................................... A PHỤ LỤC B .....................................................................................................................B PHỤ LỤC C.................................................................................................................... C PHỤ LỤC D.................................................................................................................. D1 PHỤ LỤC E .....................................................................................................................E PHỤ LỤC F ...................................................................................................................F1 PHỤ LỤC G.................................................................................................................... G 8 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL ................................................................ 10 Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mẫu...................................................................... 17 Bảng 4.1: Địa điểm và số lượng mẫu thu............................................................. 21 Bảng 4.2: Kết quả tăng sinh lần 1 ........................................................................ 22 Bảng 4.3: Kết quả cấy ria VKL trên đĩa thạch ..................................................... 23 Bảng 4.4: Kết quả thử khả năng sinh chất kháng khuẩn ...................................... 28 Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus........................................... 30 Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth..................................................... A Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar ...................................................... A Bảng D1: Bảng mã mẫu ...................................................................................... D1 Bảng D2: Kết quả thử khả năng sinh CKK của VKL phân lập được ................. D3 Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc................................................................................F1 9 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá..................................................................... 3 Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép ................................................................... 4 Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm.................................................................. 5 Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc ................................................................. 5 Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm ................................................................ 6 Hình 2.6: Pediococcus.......................................................................................... 12 Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm............................................................... 19 Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình............................................................................. 19 Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp .......................................................................... 20 Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VKL .................................................. 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả năng phân giải CaCO3 ............................................. 25 Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mẫu thử catalase âm tính . 25 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của mẫu ................................................................. 27 Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh ra từ VKL ...................................................... 30 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VKL: Vi khuẩn lactic CKK: Chất kháng khuẩn 10 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu cầu xuất khẩu nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày càng cao. Bệnh trên tôm, cá và các loài thủy đặc sản khác cũng xuất hiện ngày càng nhiều. Bệnh đã gây nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản. Sản phẩm làm ra không được tiêu thụ hoặc chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khẩu. Do đó, công tác phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản đang đòi hỏi cấp bách. (Bùi Quang Tề, 2008). Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá mức và không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các loại mầm bệnh ngày một gia tăng. Việc sử dụng các dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic (VKL). VKL là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hoá chất bột đường và chúng được xếp vào họ Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương và csv., 2009). VKL có ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành công nghiệp. Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004). Trong quá trình lên men, VKL sinh ra các axit hữu cơ, chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó (Lê Văn Nhương và csv., 2009). Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay, đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm thủy sản lên men có khả năng kháng khuẩn ” được thực hiện. 11 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nhằm tìm ra một số dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men. 1.3 Nội dung nghiên cứu • Phân lập một số dòng VKL trong các sản phẩm mắm và nước mắm. • Kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nhóm VKL phân lập được. 12 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản Mắm là sản phẩm đặc trưng của các tỉnh Nam Bộ, tùy vào điều kiện tự nhiên đặc trưng của mỗi vùng mà các sản phẩm mắm cũng đa dạng không kém. Ở các tỉnh đầu nguồn như An Giang, Đồng Tháp nổi tiếng với các sản phẩm mắm cá nước ngọt như mắm cá Lóc, mắm cá Trèn, mắm cá Rô…. Có nhiều cơ sở mắm đã đăng kí bảng quyền thương hiệu và được xuất khẩu như Mắm bà giáo Khỏe, Mắm cô Tư Ấu. Về các tỉnh ven biển Bạc Liêu, Cà Mau cũng vang danh với các loại mắm cá đặc trưng của vùng nước lợ mặn như: mắm cá Phi, mắm cá biển, mắm Ba khía, mắm Tép…. Mắm prohoc một sản phẩm mắm quen thuộc của người dân Khmer hay mắm Tôm chà đặc sản của vùng Gò Công, Tiền Giang. Phần lớn các sản phẩm mắm đều sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống. Quy trình sản xuất của một số sản phẩm mắm Quy trình làm mắm cá có 4 công đoạn: làm cá, muối cá, thính cá, chao mắm. Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Cá làm sạch bỏ ruột, mang, vẩy Vớt cá ra để ráo và rãi thính vào lưng, vào bụng Ướp muối vào bụng, vào lưng (1 kg muối cho 5 kg cá) Chao mắm với cơm rượu trộn chung với đường chảy nấu lỏng Cho vào mái đầm đậy kín (1 tháng) Cho vào mái đầm đậy kín (2 tháng) Mắm thành phẩm Cho vào mái đầm đậy kín (2 tháng) 13 Quy trình làm mắm tép Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Tép sống làm sạch, rửa nước muối Trộn đều với rượu (khoảng 30 phút) Ướp gia vị: tỏi, riềng, ớt, đường, nước mắn Cho vào lọ thủy tinh, đậy lá ổi,lá chùm ruột để lên trên và gài chặc lại Tép dậy nước là dùng được Phơi nắng 2 ngày 14 Quy trình làm mắm tôm Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Các công đoạn làm mắm ruốc Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Ruốc tươi đem xào sơ với một ít muối hạt Phơi nắng Để vài giờ cho ngấm muối Cho vào cối quết thật nhuyễn với muối trắng mịn theo công thức 3 ruốc: 1 muối Khoảng 1 giờ Mắm lên men chua, chuyển sang màu đỏ tươi và dậy mùi thơm là dùng được Tép tươi sống đem say hoặc chà nát Cho vào dụng cụ chứa, phơi nắng, khuấy đều Trộn muối vừa đủ sao cho enzyme trong ruột tép hoạt động được Mắm tôm có màu và hương vị đặc trưng 6 – 12 tháng 15 Trong các sản phẩm lên men thủy sản, nước mắm là loại sản phẩm được nhắc đến nhiều nhất. Nước mắm được sản xuất hầu hết các nước Châu Á tuy nhiên mỗi quốc gia có phương pháp lên men truyền thống khác nhau, tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau. Về cơ bản, nước mắm là dung dịch đạm (chủ yếu là các axit amin) được tạo thành do quá trình thủy phân protein nhờ các hệ enzyme protase có trong cá. Quy trình sản xuất nước mắm truyền thống Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Cá Lựa chọn Xử lý Trộn muối Lên men Làm nguội Chiết rút Nước mắm thành phẩm Bã Phụ gia 16 2.2 Vi khuẩn lactic Lên men lactic là quá trình thu nhận năng lượng nhờ VKL, bao gồm sự biến đổi một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra (Lương Đức Phẩm và csv, 2009): C6H12O6 = 2CH3CHONCOOH + 0,075x106J . VKL được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Các sản phẩm lên men axit lactic truyền thống đã được sử dụng lâu đời như lên men rau hoa quả, lên men thịt, lên men cá. Nhưng mãi đến năm 1878, Lister mới phân lập được VKL, ông gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Trestococcus lactic). Từ đó đến nay, nhiều loại VKL được phát hiện và ứng dụng có ích của chúng ngày càng đựợc mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là thực phẩm và thực phẩm chức năng. Công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic có thể nói được hình thành từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997). Những loài vi khuẩn lactic khác nhau có sự thích nghi để phát triển rộng rãi trong điều kiện môi trường khác nhau, và chúng được phổ biến rộng rãi trong tự nhiên. Vi khuẩn lactic thường được tìm thấy ở đường tiêu hóa (dạ dày và ruột non) của các loài động vật khác nhau (chuột, lợn, gia cầm và con người) (Tannock, 1988 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997). Trong sữa và các sản phẩm từ sữa (Sharp, 1981 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997), các sản phẩm thủy sản (Mauguin và Novel, 1994 được trích dẫn bởi Einar Ringo et al., 1997), và trên một số bề mặt hệ thực vật (Keddie, 1959 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997). Chúng