Luận văn Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với e. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN QUỲNH NAM PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATE BACILLUS SUBTILIS IN PIG FECES AND TEST THE ANTAGONISM WITH E. COLI K88 Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student Dr. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và trang bị cho em những kiến thức cần thiết nhất để em hoàn tất khóa luận này. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. Các Thầy, Cô tại phòng thực tập vi sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phòng vi sinh đã khuyến khích , ủng hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006 Nguyễn Quỳnh Nam iv TÓM TẮT Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13 chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12 giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................... i Tóm tắt ................................................................................................................... ii Mục lục .................................................................................................................. iii Danh mục các chữ viết tắt ..................................................................................... iv Danh sách các hình ................................................................................................ v Danh sách các bảng ............................................................................................... vi 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3 2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy ......................................................................... 3 2.2. Enterotoxigenic E. coli .............................................................................. 4 2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT ...................................................................... 4 2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 .................................................................. 4 2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 ......................................... 4 2.2.2. Độc tố kháng nhiệt .......................................................................... 5 2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa ........................................................ 5 2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb ........................................................ 6 2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC ................................... 7 2.3. Chế phẩm sinh học .................................................................................... 9 2.3.1. Định nghĩa ....................................................................................... 9 2.3.2. Cơ chế tác động .............................................................................. 9 2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học .................................................. 9 2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học .................................................... 10 2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10 2.4. Bacillus subtilis ....................................................................................... 11 2.4.1. Đặc điểm phân loại ........................................................................ 11 2.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 11 2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis ...................................... 13 2.5.1. Giới thiệu ........................................................................................ 13 2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome ........................... 14 2.5.2.1. Subtilin ............................................................................... 14 2.5.2.2. Subtilosin ............................................................................ 15 2.5.2.3. Sublancin ............................................................................ 16 2.5.2.4. TasA ................................................................................... 16 2.5.3. Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome ............... 18 2.5.3.1. Surfactin ............................................................................. 17 2.5.3.2. Fengycin ............................................................................. 19 2.5.3.3. Mycosubtilin ....................................................................... 29 2.5.3.4. Bacilysocin ......................................................................... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 22 vi 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .................................................... 22 3.1.1. Thời gian ....................................................................................... 22 3.1.2. Địa điểm ........................................................................................ 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................... 22 3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................. 22 3.2.2. Hóa chất ......................................................................................... 22 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...................................................... 22 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 22 3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ...................... 22 3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa ............................................................ 23 3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA ........................... 24 3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSB .............. 24 3.3.5. Thử kháng sinh đồ ......................................................................... 24 3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% ........... 24 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 25 4.1. Kết quả .................................................................................................... 25 4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo ........................ 25 4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA ............... 27 4.1.3. Kết quả đối kháng trên môi trƣờng TSB ....................................... 29 4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ ............................................................. 30 4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột ............................... 32 4.2. Thảo luận .................................................................................................. 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 33 5.1. Kết luận ................................................................................................... 33 5.2. Đề nghị .................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 34 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 39 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ETEC : Enterotoxigenic E. coli EAEC : Enteroaggregative E. coli LT : Heat-labile toxin ST : Heat-stable toxin CT : Cholera enterotoxin EAST : Enteroaggreative stable-toxin ENS : Enteric nervous system GC-C : Guanylate cyclase C ABC : ATP-binding cassette viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA .............................................. 25 Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2 ............................................................... 27 Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ ........................................................................ 31 Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm ................. 28 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng là 10-2 trên môi trƣờng TSA ................... 27 Bảng 4.2 : Kết quả số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ .......................................................................................... 29 Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng ....... 30 Bảng 4.4 : Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trên môi truờng thạch tinh bột 1% ................................................................. 32 1 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU 2. 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Enterotoxigenic E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đƣờng tiêu hóa của heo và ngƣời, chiếm đến 66,7% trƣờng hợp tiêu chảy trên heo còn non và heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngƣời chăn nuôi. Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E. coli, thì việc sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đó sử dụng probiotic đƣợc xem nhƣ là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh. Hiện nay Bacillus subtilis đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều do có nhiều ƣu điểm thỏa mãn đƣợc yêu cầu của sản phẩm probiotic hơn so với các chủng vi sinh vật khác. Mặc dù vậy vẫn chƣa có một sản phẩm probiotic từ Bacillus subtilis có thể ngăn ngừa một cách có hiệu quả bệnh tiêu chảy. Bên cạnh đó một số sản phẩm probiotic phòng bệnh tiêu chảy trên thị trƣờng của Việt Nam nhƣ Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng đƣợc nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú. Do đó tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy và không mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết. Trƣớc tình hình đó đƣợc sự phân công của khoa công nghệ sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts. Nguyễn Ngọc Hải chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”. 2 1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho việc ứng dụng vào trong chăn nuôi. 1.2.2 Yêu cầu Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo ở Đồng Nai và Bình Dƣơng. Chọn lọc đƣợc dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E. coli. Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh trong môi trƣờng TSB. Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp kháng sinh đồ. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1%. 3 3. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4. 2.1 E. coli gây bệnh tiêu chảy Escherichia coli là vi khuẩn đƣờng ruột gram -, là loài chiếm ƣu thế trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật, hầu hết E. coli là những chủng có lợi giúp cân bằng hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột tuy nhiên có một số chủng có khả năng gây bệnh cho ngƣời và động vật, trẻ sơ sinh và động vật còn non dễ bị xâm nhiễm bởi những chủng gây bệnh khi hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột bị rối loạn, cơ thể thú bị suy giảm miễn dịch, hoặc cơ thể thú nhạy cảm với một số chủng vi khuẩn nhất định. Để có thể gây bệnh các chủng E. coli này cần phải gắn đƣợc vào tế bào thành ruột, tránh sự bảo vệ của cơ thể vật chủ, gia tăng số lƣợng sau đó làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột, các loại E. coli gây bệnh khác nhau có cơ chế gây bệnh khác nhau, do đó dựa vào sự tƣơng tác của E. coli với tế bào thành ruột có thể chia các chủng E. coli gây bệnh thành ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), diffusely adherent E. coli (DAEC) (12). Các chủng E. coli gây bệnh còn đƣợc phân biệt với nhau bằng các phản ứng ngƣng kết kháng nguyên. Sự xâm nhiễm của các chủng E. coli gây bệnh dẫn đến các rối loạn trong hệ thống tiêu hóa, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng, sau khi cố định trên tế bào thành ruột các chủng E. coli này tiết ra độc tố làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn đƣợc mã hóa trên cùng plasmid hoặc đƣợc tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn, có một vài tính trạng riêng biệt đƣợc mã hóa trên transposome hay phage. Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên heo. 2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) Enterotoxigenic E. coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST (heat-stable toxin). ETEC có khả năng gây ra hiện tƣợng tiêu chảy trên heo, trên ngƣời và các loài thú khác. Mỗi chủng ETEC có thể mang gene mã hóa cho 1 loại độc tố 4 hoặc có thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này có khả năng cùng đƣợc biểu hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đó thì LT có ảnh hƣởng rất lớn đối với độc tính của vi khuẩn (11). 2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với cholera enterotoxin (CT) đƣợc sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae. LT có hai nhóm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn dịch chéo với nhau. LT-1 đƣợc biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên ngƣời và động vật còn LT-2 chỉ đƣợc tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập đƣợc trên động vật và một số rất ít chủng phân lập đƣợc trên ngƣời tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy LT-2 có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu vào LT-1. 2.2.1.1 Cấu tạo của LT-1 LT1-1 trọng lƣợng phân tử là 86 kDa đƣợc cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng lƣợng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B có trọng lƣợng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn vị B sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 nối với nhau bằng cầu nối disulfic, LT-1 có hai loại là LTh-1 có độc tính trên ngƣời và LTp-1 có độc tính trên heo. 2.2.1.2 Cơ chế tác động của độc tố LT-1 Sau khi gắn vào màng tế bào chủ LT-1 đƣợc chuyển vào trong tế bào, mục tiêu của LT-1 là adenylate cyclase, enzyme này nằm trên lớp màng phân cực của tế bào biểu mô ruột. Tiểu đơn vị A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hóa hoạt tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đó gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khi hàm lƣợng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A, enzyme này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào biểu mô ruột, sự phosphoryl hóa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đó ion clorua sẽ bị tiết ra ngoài qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên ngoài vào bởi các tế bào lông ruột, do đó tăng nồng độ ion trong ruột làm nƣớc bên 5 trong tế bào bị kéo ngƣợc ra ngoài và dẫn đến hiện tƣợng tiêu chảy bên cạnh đó còn có các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp ứng miễn dịch của tế bào thành ruột với độc tố cho nên có ít nhất một cơ chế tác động đồng thời với cơ chế tăng hàm lƣợng cAMP. LT bị sử lý để mất hoạt tính ADP-ribosyltransferase còn có tác động nhƣ một tá dƣợc. LT-2 có 55 – 57 % tƣơng đồng với LT-1 ở tiểu đơn vị A, nhƣng không cho thấy sự tƣơng đồng ở tiểu đơn vị B, LT-2 có hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-2a và LT-2b hai kiểu kháng nguyên này có sự tƣơng đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A và 66% ở tiểu đơn vị B. LT-2 có cơ chế tác động tƣơng tự LT-1 là gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khác biệt là receptor của LT-2 là GD1 còn của LT-1 là GM1, tuy nhiên nhƣ đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-2 gây độc cho tế bào của ngƣời và động vật. 2.2.2 Độc tố kháng nhiệt (heat-stable toxin ST) ST là protein nhỏ chỉ đƣợc cấu tạo từ một đơn vị, nhƣng trong cấu trúc chứa nhiều amino acid cy