Luận văn Phân tích đột biến gen tarn và nd3 của adn ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------  ------- NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Nguyễn Thị Ngọc Tú PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của TS. Đỗ Minh Hà và các anh chị, các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên. Tôi xin chân thành cảm ơn. Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội và khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức, Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, Ban lãnh đạo và bạn bè đồng nghiệp Bệnh viện 19-8 đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng 12 năm 2012 Học Viên Nguyễn Thị Ngọc Tú MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... a DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... c DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... d MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1- TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. TY THỂ ........................................................................................................ 3 1.1.1. Hệ genome ty thể ................................................................................... 3 1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể ....................................................... 5 1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư .................................................... 7 1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................................................ 10 1.2.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng ...................................................... 10 1.2.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng ............................................... 11 1.2.3. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học ......................... 12 1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20] ...................... 15 1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .. 16 1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể ..................................................... 17 1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể ................................................. 19 1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh ... 22 1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nước ...................................................... 24 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................... 26 2.1. NGUYÊN LIỆU ......................................................................................... 26 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................... 26 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 26 2.1.3. Thiết bị ................................................................................................ 27 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 28 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ............................................................. 28 2.2.2. Khuếch đại đoạn gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR . 29 2.2.3. Phân tích RFLP .................................................................................... 31 2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn 32 2.2.5. Tinh sạch ADN .................................................................................... 35 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 37 3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................... 37 3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thư đại trực tràng .................. 37 3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể ....................................... 38 3.1.3. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể .......... 38 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................... 40 3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen 10398 của ADN ty thể ..................................... 40 3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G .................. 41 3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G ....................... 42 3.2.4. Phân tích mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng ........................................ 46 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 59 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 61 PHỤ LỤC................................................................................................................. i Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân cùng đặc điểm lâm sàng ..................................... i Phụ lục 2. Kết quả giải trình tự đoạn 10398 ........................................................ vi Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ a BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ bp Base pair (cặp bazơ) CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển mãn) cs Cộng sự DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid KSS Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre) LHON Leber hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber) LS Leigh syndrome (Hội chứng Leigh) MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke -like episodes (Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ) MERRF Myoclonus epilepsy and ragged red fibers (Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở) mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thể) NARP Neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa (Bệnh thần kinh, mất điều hòa và thoái hóa võng mạc) ND3 NADH dehydrogenase 3 PCR Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ b RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng) SDS Sodium dodecyl sulfate SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) TBE Tris borate EDTA TNM TumorNodeMetastasis Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ c DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29] .................... 13 Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau [29] ............................................................................................................... 15 Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng ............................................................................. 26 Bảng 4. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 26 Bảng 5. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 27 Bảng 6. Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR ....................................... 29 Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l ......................... 30 Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI .... 32 Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] ................. 33 Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] ...... 34 Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm 35 Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng ........................................................... 46 Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ d DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]. ........................................................ 4 Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] ........................................ 6 Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19] ....................... 8 Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76]. ..................................................................... 11 Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77]. ........................... 15 Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59]. ................................... 17 Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô ........................................ 37 Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 ............................................... 38 Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII........................... 39 Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398 ............................................ 41 Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI ......................... 42 Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G....................... 43 Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể ..................................................................................................... 44 Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G ................................. 44 Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể ......................................................................................................................... 45 Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô. .................................. 48 Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính. ................................... 49 Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi. .......................................... 50 Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ e Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u. .............................. 51 Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thước u. ............................ 52 Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch. .................................... 53 Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM. ........................ 54 Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa. ....................... 55 Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ 1 MỞ ĐẦU Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn. Ty thể được coi là trung tâm năng lượng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành năng lượng mà tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể còn đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác như apoptosis (quá trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. Cho đến nay, người ta đã thống kê được trên 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do ADN ty thể quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường được biểu hiện rất đa dạng, chúng có thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột biến do thay đổi các nucleotide [57]. Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học. Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các dấu chuẩn di truyền của mẹ Trong số các lĩnh vực này phải kể đến ung thư – đề tài thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Ung thư đại trực tràng là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới. Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày. Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ 2 nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể, đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng” với mục đích:  Phát hiện đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP.  Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam. Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ 3 Chương 1- TỔNG QUAN 1.1. TY THỂ Ty thể là bào quan có chức năng chuyển hóa năng lượng trong chất dinh dưỡng thành năng lượng trong ATP. Ty thể có trong tất cả tế bào nhân chuẩn. Ty thể được Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 được Benda đặt tên là mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thường có dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dưới kính hiển vi thường [3]. Ty thể được coi là trung tâm năng lượng của tế bào vì là nơi chuyển hóa các chất hữu cơ thành năng lượng tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa như: Apoptosis (quá trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. 1.1.1. Hệ genome ty thể Ty thể có chứa ADN, do đó nó là một hệ di truyền tự lập khác với hệ di truyền của nhân tế bào. ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thước 16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa. Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã của ty thể [10] (hình 1). Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của tế bào chất. Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng trong mô [60]. Hệ Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ 4 gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen ty thể không tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thểKhi vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi polypeptide được mã hóa trong ty thể [41]. Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]. Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có intron, không có histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51]. Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến, tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy). ADN ty thể có thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là như nhau. Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngưỡng đột biến Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________ 5 [51]. Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể. 1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể Những đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từ đầu những năm 1980, và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã được tìm thấy [68]. Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các hư hại trong quá trình tạo ATP. Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhu cầu tối thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hư hỏng của các protein tham gia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa. Số lượng các phân tử ADN ở các mô, các cơ quan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau. Bởi vậy, các mô bị ảnh hưởng nhiều nhất của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ xương, tim, thận, gan, tụy. Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa trẻ còn nhỏ