Luận văn Phát triển quy trình mpcr phát hiện MBV (monodon baculovirus), wssv (white spot syndrome virus) và gen beta - Actin trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô Bùi Thị Bích Hằng đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo, cung cấp tài liệu cũng như những kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành được đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn toàn thể quý thầy cô, anh chị Bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp. Chân thành cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên và ủng hộ tôi thực hiện được đề tài này. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon). Sau khi thực hiện quy trình mPCR của (Karlo et al., 2006) với mẫu dương tính với MBV cho kết quả ở vị trí 361bp. Sau đó tiếp tục phát triển quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và gen β-actin cho kết quả hiện hai vạch ở vị trí 361bp (MBV) và 216 (β-actin). Trên cơ sở kết quả đạt được, thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV kết quả cho thấy hiện vạch 1441bp (WSSV) ở bước 1, hiện đồng thời hai vạch 941bp (WSSV) và 361bp (MBV) ở bước 2. Thực hiện tiếp quy trình phát hiện MBV, WSSV và gen β-actin nhưng kết quả ở hai bước chỉ hiện vạch của WSSV (1441bp, 941bp). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ i TÓM TẮT ................................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................... vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 2 2.1 Tình hình chung về tôm ........................................................................... 3 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thới giới ............................................... 3 2.1.2. Tình hình ở Việt Nam ................................................................ 4 2.2. Tổng quang về tình hình dịch bệnh trên tôm............................................ 5 2.2.1. Trên thới giới............................................................................. 5 2.2.2. Ở Việt Nam ............................................................................... 7 2.3. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) ...................................................... 8 2.3.1 Tác nhân gây bệnh ..................................................................... 8 2.3.2 Vật chủ cảm nhiễm ..................................................................... 8 2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................ 8 2.3.4 Kiểu lan truyền ........................................................................... 9 2.3.5 Phương pháp chuẩn đoán ............................................................ 9 2.3.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh ................................................... 10 2.4. Bệnh đốm trắng WSSV .......................................................................... 11 2.4.1 Tác nhân gây bệnh .................................................................... 11 2.4.2 Vật chủ cảm nhiễm .................................................................... 11 2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý ....................................................................... 12 2.4.4 Kiểu lan truyền .......................................................................... 12 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán ........................................................... 13 2.4.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh ................................................... 14 2.5.Sơ lược về gen β-actin ............................................................................ 14 2.6. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................... 14 2.6.1 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR ................. 16 2.6.2 Ứng dụng của phương pháp PCR Thủy sản ............................... 17 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 19 3.1. Thời gian và địa điễm nghiên cứu .......................................................... 19 3.2. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 19 3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................. 20 3.3.2. Ly trích DNA ........................................................................... 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 3.3.3. Đo hàm lượng DNA ................................................................ 21 3.3.4. Quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) ................... 21 3.3.5. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin ............... 22 3.3.6. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và WSSV ........................ 23 3.3.7. Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β – actin .............................................................................................................. 25 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 26 4.1. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) ...... 27 4.2. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và gen β – actin ...... 29 4.3. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV ................ 31 4.4. Thực hiện quy trình mPCR phát hiệnMBV,WSSVvà β–actin ...... 34 4.5.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và β –actin ................ 36 4.6.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV .................. 39 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................. 40 5.1. Kết luận ....................................................................................... 40 5.2.Đề xuất ........................................................................................ 41 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) ............................................................................. 3 Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) ..................................................................................................... 5 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998) , β-actin (Oanh, 2007), WSSV (OIE, 2006) ................... 20 Bảng 3.4. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV ........................................................................... 21 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin ...................................................... 22 Bảng 3.6. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) ............................................ 23 Bảng 3.7. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) ............................................. 24 Bảng 3.8. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) ......................... 25 Bảng 3.9. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) ......................... 25 Bảng 4.10. Hàm lượng ADN của mẫu tôm sú .............................................. 27 Bảng 4.11. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV ........................................................................... 28 Bảng 4.12. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin ...................................................... 30 Bảng 4.13. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) ............................................. 31 Bảng 4.14. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) .............................................. 31 Bảng 4.15. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) đã được điều chỉnh. ............. 33 Bảng 4.16. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) . ........................ 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi Bảng 4 .17. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) . ........................ 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) ...................................................................................................................... 4 Hình 2.2. Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực ( Nguồn tổng cục thống kê, 2008) ............................................................................................................ 5 Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề, 2004) . ........................................................................................................... 9 Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X). (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)…….........................................................................................................10 Hình 2.5 Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) .................................................................................................................... 10 Hình 2.6. Tôm sú bị bệnh đốm trắng WSSV, có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi Quang Tề, 2004) ......................................................................................... 12 Hình 2.7. Tôm sú bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bị dạ dày trương to có thể vùi màu hồng, mẫu nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) ......................... 13 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV ......................... 27 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV. ........................ 29 Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin ... 30 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV ....... 32 Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV sao khi chuẩn hóa .................................................................................................... 34 Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin ............................................................................................................ 36 Hình 4.14. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin ... 37 Hình 4.15. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin .. 38 Hình 4.16. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV ....... 39 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 1 - CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Việt Nam có diện tích mặt nước lớn, kể cả nước ngọt, lợ và mặn, đây là một lợi thế cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản và cũng là một trong những lý do dẫn tới sự thành công của ngành trong thời gian qua. Việt Nam đã trở thành nước nuôi trồng thủy sản lớn thứ 3 và là một trong 10 nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới. Theo bộ thủy sản 2006, sản lượng thủy sản nuôi trồng của Việt Nam đạt 1,67 triệu tấn với giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn ngành đạt 3,35 tỷ USD. Đồng bằng Sông Cửu Long có diện tích tự nhiên khoảng 39.747 km2, chiếm 12% diện tích cả nước. Trên thực tế, nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở ĐBSCL đã trở thành một nghề truyền thống và không ngừng thay đổi. Theo tính toán, tổng diện tích có khả năng NTTS ở ĐBSCL hơn 1.200.000 ha, bằng gần 60% của cả nước. Trong đó, diện tích có khả năng NTTS vùng triều khoảng 750.300 ha, chiếm trên 26% tổng diện tích đất tự nhiên của 8 tỉnh ven biển của vùng và chiếm 74% tổng diện tích có khả năng NTTS trên vùng triều toàn quốc. Năm 2006, sản lượng NTTS vùng ĐBSCL đạt khoảng 1.200.000 tấn, bằng trên 70% sản lượng NTTS toàn quốc. Trong đó Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm cao là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam cũng như một số nước đang phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Việt Nam... và Nam Mỹ (Ecuador). Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho người nuôi thủy sản. Tuy nhiên, khi nghề nuôi tôm được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ ngày càng thường xuyên và nghiêm trọng do sự suy thoái về môi trường và sự lây lan mầm bệnh. Đặt biệt là bệnh do virus trên tôm sú như: bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus – WSSV), bệnh MBV (monodon baculovirus), bệnh đầu vàng (yellow head virus – YHV),…đã và đang gây thiệt hại nặng nề cho người nuôi. Do đó, việc phát hiện phát hiện sớm bệnh để giảm thiệt hại cho người nuôi, đồng thời nâng cao chất lượng và sản lượng tôm nuôi là vấn đề quan tâm hàng đầu của ngành thủy sản và của người nuôi tôm. Có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh như: phương pháp chẩn đoán truyền thống bằng cách quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học nhưng nó lại không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp phân tử như lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR được phát PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 2 - triển nhằm khắc phục những nhược điểm trên. Phương pháp PCR hiện đang được sử dụng rất rộng rải và hiệu quả trong việc xét nghiệm tôm giống. Trong đó phương pháp được xem là hiệu quả nhất là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) nên nó được cải tiến không ngừng để có thể phát hiện sớm, phát hiện đồng thời và chính xác tác nhân gây bệnh. Từ đó, đề tài: “ Phát triển qui trình mPCR (multiplex Polymerase Chain Reaction) phát hiện đồng thời MBV (M onodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) và gen beta – actin của tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài Phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV, WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) và kiểm soát kết quả âm tính giả. Nội dung đề tài Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006) Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và nội chuẩn β – actin Thực hiện quy trình mPCR phát hiện WSSV, MBV và nội chuẩn β – actin PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 3 - CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tình chung về tôm 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thới giới Tổng sản lượng tôm của thế giới là 1,6 triệu tấn năm 2003 và có giá trị tương đương 9000 triệu đôla. Khoảng 75% là từ các nước châu Á, như Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ..., 25% còn lại là từ nước Nam Mỹ. Trung Quốc hiện là nhà xuất khẩu lớn nhất. (FAO, 2004) Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (P. monodon), tôm thẻ Trung quốc (P. chinensis) và tôm chân trắng (P. vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Nếu tính về sản lượng thì tôm sú chỉ xếp thứ 20 trong số các loài thuỷ sản nuôi nhưng về giá trị thì chúng đứng đầu với 4.046 tỷ USD trong năm 2000. (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) Năm 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Trung Quốc 78 126 146 205 210 Thái Lan 278 259 233 115 230 250 Việt Nam 53 58 105 148 128 105 Indonesia 121 125 126 81 118 110 Ấn Độ 97 95 65 130 114 Ecuador 96 98 119 66 108 Philippine 90 76 40 34 40 Tôm sú đã được nuôi ở rất nhiều quốc gia trên thế giới, tính đến nay có hơn 65 nước và vùng lãnh thổ đang tiến hành nuôi, tập trung ở hai khu vực chính là Châu Á Thái Bình Dương chiếm 72% và Mỹ La Tinh chiếm 28% tổng sản lượng tôm nuôi. (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 4 - Hình 2.1: Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Bờ biển Việt Nam trãi dài 3.260 km suốt từ Bắc vào Nam là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 250.000ha năm 2000 lên đến 959.000 ha năm 2005 (Tạp chí thủy sản, 2006). Tính đến hết năm 2005 cả nước có 4.281 trại giống sản xuất được 28,8 tỷ con tôm giống tăng 151,64% so với năm 2000. Theo số liệu hiện có, Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa Indonesia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000 ha. Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung và ở đồng bằng sông Hồng, sông Thái Bình ở miền Bắc ( 276 103.603 97.1 50 40.698 26.352 2.459 0 50 100 150 200 250 300 Th ái La n Ph ilip pin Ma lai xia Ðà i lo an Quốc gia Sả n lư ợn g (tấ n) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 5 - Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực. (Nguồn: tổng cục thống kê, 2008 ) Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (P. monodon), tôm he (P. merguiensis), tôm nương (P. orientalis), tôm đất/rảo (metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Việt Nam tồn tại 3 hình thức nuôi tôm là quãng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi thâm canh. Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) Năm Diện Tích (ha) Sản lượng ( 1000 tấn) Năng Suất(kg/ha/năm) 1995 260.000 53 200 1996 200.000 58 290 1997 195.000 105 538 1998 265.000 115 433 1999 295.000 128 433 2000 326.407 105 487 2001 446.208 159 356 2002 478.785 193 403 2.2. Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm 2.2.1. Tình hình bệnh tôm trên thế giới Tác nhân gây bệnh virus hiện nay được xem là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất làm thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm thế giới. Việc chữa trị bệnh không có hiệu quả vì hiện nay chưa có một loại thuốc hay loại 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 19 95 19 96 19 97