Luận văn Sử dụng chất chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ (Astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsilla ictaluri trên cá Tra (Pangasinodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN HỒNG LOAN SỬ DỤNG CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ CÂY HOÀNG KỲ (Astragalus membranaceus) ĐỂ PHÒNG BỆNH MỦ GAN DO VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasinodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2010 i LỜI CẢM TẠ Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ts. Đặng Thị Hoàng Oanh đã giúp đỡ, động viên và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn. Xin gửi lời cám ơn đến các thẩy cô của khoa Thủy sản, đặc biệt là các anh chị của Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản về những lời khuyên quý báu và sự chỉ dẫn tận tình trong quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cám ơn các bạn lớp cao học K15A và các em Trần Việt Tiên, Lê Thượng Khởi, Nguyễn Thị Thúy Liễu, Nguyễn Trúc Phương, Nguyễn Hà Giang, Trần Nguyễn Diễm Tú, Lê Hữu Thôi đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã chia sẽ những khó khăn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu. Chân thành cảm ơn ! ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của cây Hoàng kỳ (Astragalus radix) trong việc phòng bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Cá tra giống có trọng lượng 25 gram được bố trí các nghiệm thức (nghiệm thức 2, 4 và 6) cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất hoàng kỳ (0,5%) và các nghiệm thức (1, 3 và 5) cho ăn thức ăn bình thường trong 5 tuần. Nghiệm thức 3 và 4 được tiêm vắc- xin ở tuần thứ 3. Sau 5 tuần, cá ở các nghiệm thức 2, 3, 4 và 5 được gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp tiêm. Mỗi tuần thu mẫu 1 lần để xác định các chỉ tiêu huyết học, phân tích hàm lượng lysozyme và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh. Kết quả xác định các chỉ tiêu huyết học ở tất cả các nghiệm thức cho thấy số lượng hồng cầu dao động từ 1,4x106 đến 2,02x106 và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức có bổ sung hoàng kỳ và nghiệm thức cho ăn thức ăn bình thường. Tổng bạch cầu, tế bào lympho, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân tăng đều qua 5 tuần. Tuy nhiên sau khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri thì số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu đều giảm ở các nghiệm thức nhưng bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính lại tăng. Số lượng các chỉ tiêu huyết học của cá cảm nhiễm có bổ sung hoàng kỳ đều cao hơn cá cho ăn thức ăn bình thường và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kết quả phân tích hàm lượng lysozyme trong huyết thanh cá sau 5 tuần dao động từ 26,43 ±1,21 µg/ml đến 29,65 ±1,16 µg/ml và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) giữa nghiệm thức 3, 4 so với nghiệm thức 1, 2. Sau khi gây cảm nhiễm thì hàm lượng lysozyme ở các nghiệm thức đều giảm tuy nhiên chỉ có nghiệm thức 3 là cao nhất và khác biệt so với nghiệm thức 5. Khả năng diệt khuẩn huyết thanh của cá ở nghiệm thức 2 và 3 cao hơn cá ở nghiệm thức 1 và 5, phần trăm vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh của cá có ăn hoàng kỳ thấp hơn cá không ăn hoàng kỳ. Tỷ lệ sống của cá sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri cao nhất ở nghiệm thức 4 và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm thức 2 và nghiệm thức 3. Kết quả trên cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ vào khẩu phần thức ăn làm tăng cường khả năng đề kháng của cá với sự nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. iii ABSTRACT The aim of this study is to determine the influence of the extract of Hoang ky (Astragalus membranaceus) in the prevention of white patches in the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus). Catfish of weighing 25 grams were selected for treatments, in which the treatments 2, 4, 6 applied feeding diets containing 0,5% extract of Hoang ky and the treatments 1, 3, 5 feeding normal feed within 5 weeks. The treatments 3 and 4 were vaccinated (i.p.) against E.ictaluri at the 3rd week. After 5 weeks of feeding, the injection of bacteria E.ictaluri CAF 258 with density of 5,4x104 cfu/ml was done in the treatments 2, 3, 4, 5. Samples were weekly collected to determine haematological indicators and to analyze content of lysozyme and bactericidal capacity of serum. The results of identifying hematological targets in all treatments show that the number of red blood cells (RBC) ranged from 1,4x106 to 2,02x106 and were significantly different among the treatments with diets containing Hoang ky’s extract and those with normal feed. The number of total leukocytes, lymphocyte, neutrophil and monocyte increased over 5 weeks. However, after infection with the bacteria E.ictaluri the number of the RBC, white blood cells, lymphocyte, thrombocyte decreased in the treatments, but the number of monocyte and neutrophil increased. The number of hematological targets in all fish fed with diets containing Hoang ky are higher than that in fish fed normal feed, and this difference is statistically significant (p <0,05). Results from lysozyme analysis in serum of fish after 5 weeks ranged from 26,43 ± 1,21 µg / ml to 29,65 ± 1,16 µg / ml and differed significantly different among the treatments 3,4 and the treatments 1, 2. After causing the susceptibility, content of lysozyme in all the treatments decreased but that in the treatments 3 is highest and different from the treatment 5. Bactericidal ability of serum of fish in the treatments 2 and 3 are higher than that of fish in the treatments 1 and 5. The survival of bacteria after interaction with the serum of fish fed Hoang ky is lower than those fed normal feed. The highest survival of fish after bacterial susceptibility to E.ictaluri was in treatment 4 and significantly higher than treatments of 2 and 3. The results of this study showed that feeding of Hoang ky’s extract stimulated enhance immune response of catfish and protection against E. ictaluri. iv MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ......................................................................................................................... i TÓM TẮT.............................................................................................................................. ii MỤC LỤC ............................................................................................................................ iv DANH SÁCH BẢNG........................................................................................................... vi DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... vii CHƯƠNG 1 ........................................................................................................................... 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 ........................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................................... 3 2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu ...................................................................................... 3 2.1.1Tổng quan về nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL...................................................................... 3 2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL............................................................ 4 2.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi cá tra ................................................... 6 2.2.1 Hiện trạng sử dụng........................................................................................................ 6 2.2.2 Hiện trạng kháng thuốc................................................................................................. 7 2.2.3 Tồn lưu trong môi trường và sản phầm ........................................................................ 8 2.2.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người ............................................................................. 9 2.3 Sơ lược các nghiên cứu về thảo dược ............................................................................ 10 2.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý cây Hoàng kỳ ............................................... 15 CHƯƠNG 3 ......................................................................................................................... 17 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 17 3.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................................... 17 3.2 Vật liệu nghiên cứu........................................................................................................ 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 17 3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn ........................................................................... 17 3.3.2 Thí nghiệm xác định LD50 .......................................................................................... 18 3.3.3 Thí nghiệm cho ăn thảo dược. .................................................................................... 18 3.3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm sau khi cho ăn thảo dược 5 tuần..................................... 19 v 3.3.3 Xác định hiệu quả của chiết xuất thảo dược lên sự đề kháng bệnh mủ gan trên cá tra qua các chỉ tiêu. ................................................................................................................... 19 3.4 Quản lý hệ thống thí nghiệm.......................................................................................... 21 3.5 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................................ 22 CHƯƠNG 4 ......................................................................................................................... 23 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................................. 23 4.1 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra........ 23 4.1.1 Hồng cầu ..................................................................................................................... 23 4.1.2 Bạch cầu...................................................................................................................... 24 4.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. .................................................................................................. 30 4.2.1 Hồng cầu ..................................................................................................................... 30 4.2.1 Bạch cầu...................................................................................................................... 31 4.3 Lysozyme....................................................................................................................... 33 4.3.1 Hàm lượng lysozyme trước cảm nhiễm...................................................................... 34 4.3.2 Hàm lượng lysozyme sau cảm nhiễm......................................................................... 35 4.4 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh............................................................................ 37 4.5 Ảnh hưởng của chiết xuất hoàng kỳ lên sự nhiễm bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri…. ............................................................................................................................. 39 CHƯƠNG 5 ......................................................................................................................... 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................................ 42 5.1 Kết luận.......................................................................................................................... 42 5.2 Đề xuất ........................................................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 43 PHỤ LỤC A......................................................................................................................... 52 PHỤ LỤC B......................................................................................................................... 54 PHỤ LỤC C......................................................................................................................... 55 PHỤ LỤC D......................................................................................................................... 56 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.2: Khả năng ảnh hưởng của thuốc và hóa chất dùng trong NTTS đến sức khỏe con người (Kimbrell et al., 2005). .............................................................................................. 10 Bảng 4.2 Số lượng hồng cầu trước và sau cảm nhiễm......................................................... 30 Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu sau cảm nhiễm.......................................................... 33 Bảng 4.5 LD50 của vi khuẩn E. ictaluri thí nghiệm ............................................................ 39 vii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-2008 và quy hoạch đến năm 2020 ...................................................................................................... 3 Hình 2.4: Rễ và thân cây Hoàng kỳ. ................................................................................... 15 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu của các nghiệm thức thí nghiệm sau 5 tuần. 23 Hình 4.2 Bạch cầu đơn nhân (A), tiểu cầu (B), bạch cầu trung tính (C), tế bào lympho (D) và tế bào hồng cầu (E) (100X)............................................................................................. 25 Hình 4.3 Biểu đồ số lượng tổng bạch cầu ở cá tra sau 5 tuần.............................................. 27 Hình 4.4 Số lượng tế bào lympho sau 5 tuần....................................................................... 27 Hình 4.5 Số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ. ....................... 28 Hình 4.6 Số lượng tế bào bạch cầu trung tính sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ.. ..................... 28 Hình 4.7 Số lượng tế bào Tiểu cầu sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ.. ...................................... 29 Hình 4.8 Đồ thị nồng độ lysozyme chuẩn ........................................................................... 34 Hình 4.9 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau 5 tuần cho ăn Hoàng kỳ. .. ..................................................................................................................................... 35 Hình 4.10 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri.. ................................................................................................................. 36 Hình 4.11 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá trước cảm nhiễm. ................................................................................................................ 37 Hình 4.12 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá sau cảm nhiễm............................................................................................................................ 38 Hình 4.13 Cá tra thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. (mũi tên chỉ đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng) ................................................................................................................ 40 Hình 4.14 Tỷ lệ chết cá chết tích lũy sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri.. ............ 41 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong những năm gần đây phong trào nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) xuất khẩu ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) gia tăng đáng kể. Thế nhưng, do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch nên dịch bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều. Theo Phạm Đình Khôi (2009) trong vòng 5 năm qua, môi trường ô nhiễm và dịch bệnh đã làm tỷ lệ sống trung bình của cá nuôi giảm từ 90% xuống còn 80%. Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan và ctv. (2006) thì tần suất xuất hiện bệnh ở các tỉnh ĐBSCL là đốm trắng trên gan, thận: 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70% và vàng da: 21,60%. Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi. Theo nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv. (2004) thì bệnh đốm trắng trên gan cá tra là do vi khuẩn Edwardsilla ictaluri gây ra, thường xuất hiện vào mùa lũ, cao điểm là tháng 7 và tháng 8. Ngoài ra qua kết quả khảo sát của (Nguyễn Chính, 2005) cho rằng bệnh đốm trắng trên gan thân gây tỉ lệ hao hụt cao ở cá hương giống (10-90%) tổng số cá nuôi, mức độ thiệt hại có thể lên đến 60-80%. Khi dich bệnh xảy ra, để hạn chế thiệt hại người nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh từ đó dẫn đến hiện tượng kháng thuốc. Vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra đã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như oxytetracyline, oxolinic acid, sulfonamide (Từ Thanh Dung và ctv, 2004), hầu hết tất cả các chủng E. ictaluri biểu hiện tính đề kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường sử dụng trong điều trị bệnh (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007). Kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thiện Nam (2010) cho thấy đa số các chủng vi khuẩn E. ictaluri đã kháng với nhiều loại kháng sinh như: streptomycin, chloramphenicol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycyline (67,5%). Bên cạnh đó nghiên cứu cũng xác định 97,5% chủng vi khuẩn E. ictaluri biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng ít nhất 3 loại kháng sinh) và khả năng chuyển gen kháng tetracyline của vi khuẩn E. ictaluri cho vi khuẩn E.coli RC 85 với tần số tiếp hợp trung bình là 2,54x106. Hiện nay, việc phòng trị bệnh cá tra chủ yếu vẫn phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất. Điều này khiến cho việc nuôi và xuất khẩu cá tra của Việt Nam gặp nhiều khó khăn do danh mục các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong 2 nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng. Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp phòng trị bệnh có hiệu quả như sử dụng các loại thảo dược, chất tách chiết từ thảo dược và Vắc-xin là rất cần thiết nhằm đảm bảo cho sự phát triển bền vững của nghề (Phạm Văn Thư, 2006). Sử dụng thảo dược và các chất chiết từ thảo dược để phòng trị bệnh trên cá đã được nghiên cứu ở nhiều loài cá có vẩy và cá trơn như cá rô phi (Yin et al., 2006, Ardó et al., 2008), cá chép (Yin et al., 2008), cá nheo mỹ (Zheng et al., 2009) tuy nhiên trên cá tra thì chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến. Chính vì sử dụng thảo dược và các chất chiết từ thảo dược trong phòng bệnh cá là một xu hướng mới có nhiều triển vọng phát triển trong thời gian tới nên đề tài “ Sử dụng chất chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ (Astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của đề tài nhằm tìm hiểu khả năng sử dụng chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ (Astragalus radix) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri gây ra ở cho cá tra nuôi thâm canh nhằm từng bước thay thế kháng sinh trong việc phòng bệnh này. Nội dung của đề tài 1. Xác định ảnh hưởng của chiết xuất Hoàng kỳ lên các chỉ tiêu huyết học và miễn dịch của cá tra. 2. Xác định ảnh hưởng của chiết xuất Hoàng kỳ