Luận văn Tìm hiểu sự phát sinh hình thái chồi và rễ trong nuôi cấy In Vitro cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.)

22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ 3.1.1. SỰ PHÁT SINH RỄ TRỰC TIẾP TỪ LÁ VÀ TRỤ HẠ DIỆP 3.1.1.1. Sự nuôi cấy lá và trụ hạ diệp Bảng 1: Ảnh hưởng của các auxin trên sự tạo rễ ở mảnh cắt lá sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ Trọng lượng tươi (mg) Chiều dài rễ (mm) Đối chứng (MS) 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a MS + IAA 0,1 mg/l 71,4 ± 14,3b 1,5 ± 0,2b 1,3 ± 0,1ab 11,0 ± 1,0b MS + IBA 0,1 mg/l 80,9 ± 4,8b 1,6 ± 0,2b 2,5 ± 0,4b 15,9 ± 3,0b MS + NAA 0,1 mg/l 98,3 ± 1,5c 3,4 ± 0,6c 10,0 ± 1,3c 9,1 ± 1,1b MS + 2,4-D 0,1 mg/l 61,7 ± 7,3b 1,7 ± 0,3b 0,3 ± 0,1b 1,0 ± 0,1a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Mảnh cắt lá Nhàu in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các loại auxin khác nhau như IAA, IBA, NAA, 2,4-D ở cùng nồng độ (0,1 mg/l) đều kích thích sự tạo rễ. Môi trường có bổ sung NAA có tỷ lệ tạo rễ, số lượng và trọng lượng rễ cao nhất. 2,4-D 0,1 mg/l cũng kích thích sự hình thành rễ nhưng rễ không thể kéo dài (<1 mm) (bảng 1, ảnh 3). 23 Ảnh 3: Mảnh cắt lá Nhàu 4 tuần tuổi trên môi trường MS không (A) hoặc có bổ sung IAA (B), IBA (C), NAA (D), 2,4-D (E) 0,1 mg/l. E1,6 cm D1,5 cm C1,5 cm 1,6 cm B1,5 cm A 24 Bảng 2: Tỷ lệ ra rễ và số cụm rễ của lá Nhàu in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số cụm rễ 0 0,0 ± 0,0a 0,0± 0,0 a 0,1 94,4 ± 5,2c 5,3 ± 0,6 c 0,5 96,6 ± 3,2c 4,7 ± 0,6 bc 1 100,0 ± 0,0c 3,9 ± 0,5 b 1,5 61,7 ±7,3b 4,3 ± 0,4 bc Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. NAA ở nồng độ từ 0,1 mg/l đến 1,5 mg/l đều kích thích sự tạo rễ tại các vết cắt trên lá sau 4 tuần nuôi cấy. Trên môi trường MS không bổ sung NAA, lá không có khả năng tạo rễ. Mô cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l hoặc 0,5 mg/l đều có tỷ lệ ra rễ và số cụm rễ tốt nhất. NAA ở nồng độ cao (1 và 1,5 mg/l) làm mẫu cấy có hiện tượng hóa đen và chết dần (bảng 2, ảnh 4). Như vậy, trong số các auxin ngoại sinh, NAA kích thích sự tạo rễ tốt nhất. NAA ở nồng 0,1 mg/l đã có thể kích thích mạnh sự ra rễ mà không gây chết mẫu cấy. Vì thế, chúng tôi sử dụng NAA nồng độ 0,1 mg/l trong các thí nghiệm tạo rễ về sau. 25 Ảnh 4: Lá Nhàu 4 tuần tuổi trên môi trường MS không (A) hoặc có bổ sung NAA 0,1 mg/l (B), 0,5 mg/l (C), 1 mg/l (D), 1,5 mg/l (E). E 1,5 cm 1,5 cm D C 1,5 cm B 1,5 cm A1,5 cm 26 Bảng 3: Tác động của NAA 0,1 mg/l trên sự phát sinh rễ từ lá và trụ hạ diệp của cây in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy. Vật liệu thực vật Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ Chiều dài rễ (mm) Trụ hạ diệp 75,1 ± 20,2 12,2 ± 3,1 3,1 ± 0,2 Lá 71,4 ± 14,3 23,6 ± 4,3 6,9 ± 0,5 T-Test − + + +, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. −, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trụ hạ diệp và lá Nhàu in-vitro đều có sự tạo mô sẹo tại các vết thương song song với sự phát sinh rễ khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Ở trụ hạ diệp, sự tạo mô sẹo là chủ yếu, trong khi ở lá, sự tạo rễ chiếm ưu thế hơn. Số rễ và chiều dài rễ ở lá đều cao hơn so với trụ hạ diệp (bảng 3, ảnh 5). Ảnh 5: Trụ hạ diệp (A) và lá (B) 4 tuần tuổi trên môi trường MS + NAA 0,1 mg/l. B1,5 cm A1,5 cm 27 3.1.1.2. Các thay đổi hình thái tế bào trong sự phát sinh rễ trực tiếp Ở lá và trụ hạ diệp, sự tạo sơ khởi rễ bắt đầu từ tuần 1 (ảnh 6A và 6B) và sự kéo dài rễ bắt đầu ở tuần 2 (ảnh 6C và 6D). Ở trụ hạ diệp, rễ bất định có nguồn gốc từ vùng chu luân giữa hai bó mạch (ảnh 6A). Ở lá, rễ bất định cũng có nguồn gốc từ nhu mô chu luân (ảnh 6B). Ảnh 6: Sơ khởi rễ ở trụ hạ diệp (A), lá (B) Nhàu 1 tuần trên môi trường MS + NAA 0,1 mg/l và rễ bất định ở trụ hạ diệp (C), lá (D) Nhàu 2 tuần trên môi trường MS + NAA 0,1 mg/l. C 420 µm D 420 µm 400 µm BA330 µm 28 3.1.1.3. Sự thay đổi cường độ hô hấp trong sự phát sinh rễ Bảng 4: Cường độ hô hấp (µmol O2/g trọng lượng tươi/giờ) của lá và trụ hạ diệp qua các tuần khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Thời gian (tuần) Vật liệu thực vật 0 1 2 3 4 Lá 5,7 ± 0,6a 13,0 ± 0,8c 18,7 ± 0,8d 20,8 ± 1,3d 13,7 ± 0,8c Trụ hạ diệp 8,4 ± 0,3b 7,4 ± 0,2ab 13,7 ± 0,6c 4,9 ± 0,6a 6,0 ± 1,5ab T-Test + + + + + Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. +, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. −, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Dưới tác động của NAA, cường độ hô hấp ở lá tăng sớm ở tuần 1, cao nhất ở tuần 2, 3 và giảm ở tuần 4, trong khi ở trụ hạ diệp có cường độ hô hấp tăng chậm hơn, bắt đầu ở tuần 2 và giảm mạnh ở tuần 3 (bảng 4, hình 2). 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 0 1 2 3 4 Thời gian (tuần) C ườ ng đ ộ hô h ấp (µ m ol O ₂/g T LT /g iờ Lá (NAA) Trụ hạ diệp (NAA) Hình 2: Sự thay đổi cường độ hô hấp ở lá và trụ hạ diệp theo thời gian khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. 29 3.1.1.4. Sự thay đổi hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong sự phát sinh rễ Bảng 5: Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong trụ hạ diệp qua các tuần khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Thời gian (tuần) 0 1 2 4 IAA (mg/l) 3,03 ± 0,37b 4,16 ± 0,28c 3,74 ± 0,39c 3,81 ± 0,45c Zeatin (mg/l) 0,46 ± 0,02a 2,26 ± 0,23c 1,58 ± 0,21cb 0,22 ± 0,04a ABA (mg/l) 1,77 ± 0,00a 3,40 ± 0,43b 3,59 ± 0,65b 3,70 ± 1,03b GA3 (mg/l) 17,33 ± 0,44c 3,67 ± 1,03a 4,23 ± 0,96a 11,33 ± 0,23b Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Bảng 6: Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong lá qua các tuần khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Thời gian (tuần) 0 1 2 4 IAA (mg/l) 2,57 ± 0,20a 5,12 ± 0,11c 3,91 ± 0,19b 3,04 ± 0,29a Zeatin (mg/l) 1,42 ± 0,24a 1,66 ± 0,09ab 2,12 ± 0,13b 2,07 ± 0,10b ABA (mg/l) 5,34 ± 0,77ab 3,30 ± 0,33a 7,15 ± 0,65b 5,87 ± 0,65b GA3 (mg/l) 5,27 ± 0,92a 3,70 ± 0,10a 9,70 ± 0,49b 15,87 ± 0,33c Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Dưới tác động của NAA 0,1 mg/l, hoạt tính IAA ở lá và trụ hạ diệp đều tăng mạnh ở tuần 1 nhưng sau đó hoạt tính trong lá giảm ở tuần 2, trong khi ở trụ hạ diệp hoạt tính này vẫn duy trì đến tuần 4. Hoạt tính zeatin nội sinh trong lá và trụ hạ diệp bắt đầu tăng ở tuần 1 nhưng sau đó hoạt tính trong trụ hạ diệp bắt đầu giảm ở tuần 2, trong khi lá vẫn tiếp tục duy trì hoạt tính này đến tuần 4. Hoạt tính ABA ở trụ hạ diệp tăng ở tuần 1 và không đổi suốt 4 tuần nuôi cấy trong khi hoạt tính ABA giảm nhẹ trong tuần đầu tiên ở lá, sau đó tăng mạnh từ tuần 2 và duy trì đến tuần 4. Hoạt tính GA3 ở lá tăng mạnh ở tuần 2 cho đến tuần 4. Hoạt tính GA3 sẵn có trụ hạ diệp cao, khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l, hoạt tính này giảm mạnh ở tuần 1 và tăng trở lại ở tuần 4 (bảng 5 và 6). 30 3.1.2. SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ LÁ 3.1.2.1. Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo Bảng 7: Sự thay đổi trọng lượng tươi và cường độ hô hấp của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 4 và 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l. Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (mg) Cường độ hô hấp (µmol O₂/g TLT/giờ) 2 56,5 ± 3,4a 5,97 ± 0,12c 4 106,7 ± 6,1b 2,13 ± 0,03b 8 179,4 ± 8,6c 1,70 ± 0,06a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trong điều kiện tối hoàn toàn, các mẫu lá nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l hình thành mô sẹo sau một tuần. Mô sẹo xuất hiện tại những vết cắt ngang gân chính. Sau đó, kích thước và trọng lượng tươi của mô sẹo tăng dần đặc biệt là khối mô sẹo tiếp xúc trực tiếp với môi trường. Mô sẹo từ tuần 1 đến tuần 4 có màu vàng sáng, bở. Mô sẹo này bắt đầu chuyển dần sang màu nâu và trở nên chặt hơn ở tuần 8 (bảng 7, ảnh 7). 31 Ảnh 7: Mô sẹo từ lá sau 1 (A), 2 (B), 4 (C) và 8 (D) tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l. D1 cm C1,2 cm B1 cm A1 cm 32 3.1.2.2. Sự thay đổi hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l, vùng biểu bì ở gân chính của cả 2 mặt lá có sự kéo dài và bắt đầu phân chia theo hướng tiếp tuyến. Ở tuần thứ 2, các tế bào mô sẹo ở ngoài cùng tách rời nhau làm mô sẹo trở nên bở. Các nhóm tế bào này tiếp tục duy trì sự phân chia và có tế bào chất chuyển dần sang màu nâu ở tuần 8 (ảnh 8). Ảnh 8: Sự phân chia ở vùng biểu bì lá (A), mô sẹo từ lá sau 2 (B), 4 (C) và 8 (D) tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l. A400 µm D82 µm C82 µm B167 µm 33 3.1.2.3. Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng của mô sẹo Bảng 8: Hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong mô sẹo có nguồn gốc từ lá trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l sau 2, 4 và 8 tuần nuôi cấy. Hoạt tính (mg/l) Thời gian (tuần) IAA Zeatin ABA GA3 2 1,82 ± 0,08a 0,27 ± 0,06a 1,42 ± 0,24a 0,66 ± 0,31a 4 1,50 ± 0,07b 0,23 ± 0,01a 1,33 ± 0,33a 0,35 ± 0,09a 8 1,08 ± 0,07c 0,20 ± 0,03a 3,00 ± 0,27b 0,57 ± 0,13a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Không có sự thay đổi về hoạt tính cytokinin và giberelin nội sinh trong mô sẹo theo thời gian. IAA nội sinh có xu hướng giảm theo thời gian trong khi hoạt tính ABA tăng mạnh ở tuần thứ 8 ứng với sự sậm màu của mô sẹo (bảng 8, ảnh 8D). 34 3.1.3. SỰ PHÁT SINH RỄ TỪ MÔ SẸO 3.1.3.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo trong sự phát sinh rễ từ mô sẹo Bảng 9: Sự hình thành rễ ở mô sẹo 2, 4 và 8 tuần tuổi sau 4 tuần chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tuổi mô sẹo (tuần) Thời gian hình thành rễ (tuần) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ 2 - 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 4 2 3,3 ± 0,3b 0,2 ± 0,1a 8 1 100,0 ± 0,0c 4,5 ± 1,3c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Sau khi được chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, mô sẹo 2 tuần tuổi có nguồn gốc từ lá Nhàu không phát sinh rễ sau 4 tuần; mô sẹo 4 tuần tuổi bắt đầu xuất hiện rễ ở tuần thứ 2, trong khi mô sẹo 8 tuần tuổi phát sinh rễ sớm hơn (ở tuần thứ 1) với tỉ lệ tạo rễ và số rễ cao nhất (bảng 9). 35 3.1.3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh trong sự hình thành rễ từ mô sẹo Bảng 10: Sự phát sinh rễ từ mô sẹo 8 tuần tuổi sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D, NAA, BA riêng lẻ hay phối hợp ở các nồng độ khác nhau. Nghiệm thức Thời gian hình thành rễ (tuần) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ MS 1 100,0 ± 0,0e 4,1 ± 0,5bc MS + NAA 0,1 mg/l 1 81,0 ± 1,0d 6,9 ± 1,0c MS + BA 0,2 mg/l 1 70,0 ± 5,0c 2,7 ± 0,6b MS + 2,4-D 0,1 mg/l - 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a MS + NAA 0,1 mg/l BA 0,1 mg/l 1 83,3 ± 3,3d 4,3 ± 0,5bc MS + NAA 0,1 mg/l BA 0,2 mg/l 1 41,0 ± 4,9b 4,2 ± 0,8bc Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Mô sẹo chuyển sang các môi trường MS không bổ sung 2,4-D đều cho sự tạo rễ sau 1 tuần nuôi cấy, trong khi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 0,1 mg/l thì mô sẹo lại tiếp tục tăng trưởng mà không phát sinh rễ. Tỷ lệ phát sinh rễ từ mô sẹo cao nhất trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tỷ lệ này giảm nhẹ khi bổ sung NAA 0,1 mg/l và giảm nhiều hơn khi bổ sung BA 0,2 mg/l. Số rễ trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật hoặc có bổ sung NAA 0,1 mg/l riêng lẻ hay phối hợp với BA ở các nồng độ cao hơn trên môi trường chỉ bổ sung BA 0,2 mg/l. 36 Ảnh 9: Mô sẹo 8 tuần tuổi sau 4 tuần nuôi cấy trên các môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật (A) hoặc có bổ sung 2,4-D 0,1 mg/l (B), NAA 0,1 mg/l (C), BA 0,2 mg/l (D), BA 0,1 mg/l + NAA 0,1 mg/l (E) và BA 0,2 mg/l + NAA 0,1 mg/l (F). E1,2 cm D1,2 cm F1,2 cm A1,5 cm B1 cm C1,5 cm 37 3.1.3.3. Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ từ mô sẹo Sau 1 tuần chuyển các khối mô sẹo sang môi trường MS không bổ sung 2,4- D, trên mô sẹo có thể quan sát thấy nhiều nhóm tế bào đang phân chia và xuất hiện cùng lúc các giai đoạn phân hóa khác nhau của các nhóm mô sẹo này. Ban đầu các tế bào mô sẹo phân chia trong một mặt phẳng, tạo thành các chuỗi gồm nhiều tế bào liên kết với nhau (ảnh 10). Sau đó, các tế bào ở 1 đầu của chuỗi phân chia theo nhiều hướng, tạo thành các khối hình cầu (ảnh 11). Các khối này có kích thước tăng dần, tẩm suberin ở lớp ngoài cùng và tạo thành các nốt tròn trong mô sẹo. Các nốt này có sự phân hóa mạch dẫn bên trong với các mạch mộc và libe (ảnh 12A). Ở nhiều nốt, sơ khởi rễ xuất hiện gần các mạch dẫn (ảnh 12B) và kéo dài (ảnh 13). Trên môi trường có bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l, sau 2 tuần, bên trong mô sẹo vẫn chứa nhiều các nốt hình cầu ở trạng thái chưa hình thành rễ (ảnh 14A). Ở các nốt đã phân hóa, song song với sự hình thành rễ, các nhóm tế bào ngoài cùng của chúng tiếp tục tăng sinh và tạo các tế bào mô sẹo dạng kéo dài (ảnh 14B). Ảnh 10: Tế bào mô sẹo đang phân chia trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, để nguyên (A) hoặc được nhuộm với acetocarmine (B). 36 µm B36 µm A 38 Ảnh 11: Sự hình thành các khối tế bào hình cầu trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, để nguyên (A) hoặc được nhuộm với acetocarmine (B). 82 µm B 82 µm A 39 Ảnh 12: Các nốt có sự phân hóa mạch (A) và tạo sơ khởi rễ (B) trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 1 tuần (Mũi tên chỉ vị trí xuất hiện sơ khởi rễ). 100 µm A 52 µm B 40 Ảnh 13: Rễ được hình thành từ các nốt trong mô sẹo (A) và sự kéo dài rễ (B) sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. 92 µm B 72 µm A 41 Ảnh 14: Mô sẹo chứa nhiều nốt tròn (A) và sự phân chia để tiếp tục hình thành mô sẹo ở vùng ngoài cùng của các nốt này (B) sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l. 50 µm B 167 µm A 42 3.1.3.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong sự phát sinh rễ từ mô sẹo Bảng 11: Cường độ hô hấp và hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong mô sẹo 8 tuần tuổi sau 0, 1 và 2 tuần cấy chuyền sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Hoạt tính (mg/l) Thời gian (tuần) IAA Zeatin ABA GA3 Cường độ hô hấp (µmol O₂ /g TLT/giờ) 0 1,08 ± 0,07a 0,20 ± 0,01a 3,00 ± 0,27b 0,57 ± 0,13a 1,70 ± 0,06a 1 1,32 ± 0,07b 0,23 ± 0,02b 1,75 ± 0,14a 0,91 ± 0,18b 2,23 ± 0,03b 2 1,40 ± 0,03b 0,25 ± 0,01b 1,50 ± 0,29a 1,49 ± 0,20c 3,83 ± 0,07c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Bảng 12: Cường độ hô hấp và hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong mô sẹo 8 tuần tuổi sau 0, 1 và 2 tuần cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l. Hoạt tính (mg/l) Thời gian (tuần) IAA Zeatin ABA GA3 Cường độ hô hấp (µmol O₂ /g TLT/giờ) 0 1,08 ± 0,07a 1,70 ± 0,06a 3,00 ± 0,27c 0,57 ± 0,13a 1,70 ± 0,06a 1 1,30 ± 0,05b 2,23 ± 0,03b 1,00 ± 0,15b 0,43 ± 0,10a 2,43 ± 0,09b 2 1,90 ± 0,03c 3,83 ± 0,07c 0,17 ± 0,06a 1,15 ± 0,20b 3,43 ± 0,13c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trên môi trường có hoặc không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, cường độ hô hấp của mô sẹo tăng dần trong 2 tuần nuôi cấy. Hoạt tính IAA và zeatin trong mô sẹo 8 tuần tuổi được chuyển sang môi trường MS bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l gia tăng mạnh hơn ở mô sẹo được chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Hoạt tính GA3 trong các mô sẹo cũng tăng dần trong khi hoạt tính ABA giảm dần qua các tuần (bảng 11, 12). 43 3.1.4. SỰ PHÁT SINH CHỒI TRỰC TIẾP 3.1.4.1. Sự nuôi cấy lá và trụ hạ diệp Bảng 13: Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau và zeatin 1 mg/l trên sự hình thành chồi bất định từ trụ hạ diệp và lá in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy. Thời gian xuất hiện chồi (tuần) Tỷ lệ tạo chồi (sau 4 tuần) (%) Số chồi (Sau 4 tuần) Nghiệm thức Lá Trụ hạ diệp Lá Trụ hạ diệp Lá Trụ hạ diệp Đối chứng (MS) - 8 0 0,0 ± 0,0a 0 0,0 ± 0,0a MS + BA 1 mg/l - 3 0 19,8 ± 4,4b 0 0,3 ± 0,1a MS + BA 2 mg/l - 3 0 79,2 ± 8,3d 0 2,2 ± 0,6b MS + BA 3 mg/l - 3 0 59,7 ± 5,0c 0 1,4 ± 0,3b MS + zeatin 1 mg/l - 2 0 96,5 ± 3,1e 0 3,6 ± 0,2c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trụ hạ diệp trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l xuất hiện chồi sớm nhất (ở tuần 2) với tỷ lệ tạo chồi và số chồi cao nhất ở tuần 4. Lá đặt trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l không phát sinh chồi sau 8 tuần (bảng 13, ảnh 15). Ảnh 15: Trụ hạ diệp Nhàu 4 tuần tuổi trên môi trường MS không (A) hoặc có bổ sung zeatin 1 mg/l (C) và lá Nhàu 8 tuần tuổi trên môi trường MS không (B) hoặc có bổ sung zeatin 1 mg/l (D). B 1 cm 1,4 D 0,6 cm C 0,6 cm A 44 Bảng 14: Ảnh hưởng của NAA 0,1 mg/l và zeatin 1 mg/l trên sự hình thành chồi bất định từ trụ hạ diệp in-vitro sau 5 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Thời gian xuất hiện sẹo (tuần) Thời gian xuất hiện chồi (tuần) Thời gian xuất hiện rễ (tuần) Tỷ lệ tạo chồi sau 5 tuần (%) Tỷ lệ tạo rễ (%) Đối chứng (MS) 5 5 - 30,0 ± 14,1a 0,0 ± 0,0a MS + zeatin 1 mg/l 1 2 - 93,4 ± 6,6b 0,0 ± 0,0a MS + NAA 0,1 mg/l + zeatin 1 mg/l 1 5 3 10,6 ± 6,8a 63,5 ± 16,5b Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Sự phối hợp giữa NAA 0,1 mg/l và zeatin 1 mg/l giúp trụ hạ diệp dễ hình thành rễ nhưng tạo chồi chậm hơn với tỷ lệ thấp hơn môi trường MS bổ sung zeatin 1 mg/l sau 5 tuần nuôi cấy (bảng 14, ảnh 16B). Ảnh 16. Trụ hạ diệp Nhàu trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l sau 5 tuần nuôi cấy (A) và NAA 0,1 mg/l + zeatin 1 mg/l sau 8 tuần nuôi cấy (B). B0,6 cm 0,6 cm A 45 3.1.4.2. Các thay đổi hình thái trong sự phát sinh chồi trực tiếp từ trụ hạ diệp trên môi trường có bổ sung zeatin 1 mg/l Có sự khác biệt trong cấu trúc của trụ hạ diệp trước (ảnh 17) và sau khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung zeatin 1 mg/l. Dưới tác động của zeatin, các tế bào nhu mô dưới biểu bì bắt đầu phân chia (ảnh 18) ở tuần thứ nhất và hình thành các trung tâm phân chia ở tuần thứ 2 (ảnh 19, 20). Sự phân chia cũng xảy ra trên khắp vùng nhu mô vỏ (ảnh 21) để sau đó phân hóa thành hệ thống mạch dẫn (ảnh 22) nối liền các chồi ở ngoại vi với hệ thống mạch dẫn của trụ hạ diệp ban đầu (ảnh 23, 24). Ảnh 17. Phẫu thức ngang trụ hạ diệp trước khi nuôi cấy. 200 µm 46 Ảnh 18. Các tế bào nhu mô dưới biểu bì trụ hạ diệp đang phân chia sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Ảnh 19. Các tế bào nhu mô dưới biểu bì trụ hạ diệp phân chia mạnh sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. 42 µm 36 µm 47 Ảnh 20. Các trung tâm phân chia được hình thành ở vùng ngoại vi sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Ảnh 21. Sự phân bào xảy ra trên khắp nhu mô vỏ của trụ hạ diệp sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. 52 µm 48 µm 48 Ảnh 22. Các nhóm tế bào trong nhu mô vỏ của trụ hạ diệp đang phân hóa mạch (mũi tên) sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Ảnh 23. Sự nối mạch giữa các sơ khởi chồi ở ngoại vi và trụ trung tâm ở trụ hạ diệp sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l.