Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM --------------------------------- NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN- 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM --------------------------------- NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN! Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi đi học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên tháng 9 năm 2009 Học viên Nguyễn Văn Tuân Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BSA Bovine serum albumin CMC Carboxyl methyl cellulose cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid DEAE Diethylaminoethyl ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid IU International unit kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani M Marker Nxb Nhà xuất bản OD Optical density PCR Polymerase chain reaction rRNA Ribosome ribonucleic acid SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TBE Tris base-Boric acid-EDTA TE Tris-EDTA v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE ............ 3 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE .................. 4 1.2.1 Nguồn gốc ............................................................................................. 4 1.2.2 Phân loại ................................................................................................ 6 1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE .......................................... 7 1.3.1 Cấu trúc bậc một .................................................................................... 7 1.3.2 Cấu trúc không gian ............................................................................... 9 1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất ......................... 9 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ........................... 11 1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................... 12 1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 12 1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ......................................... 13 1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ...................................... 15 1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ....................................... 15 1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa .............................................. 16 1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .................... 16 1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................................... 17 1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ...................... 20 1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM ...................... 22 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 25 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ............................................................... 25 2.1.1 Chủng nấm .......................................................................................... 25 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 25 2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 26 2.1.4 Môi trƣờng .......................................................................................... 26 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.5 Dung dịch và đệm ................................................................................ 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 28 2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................. 28 2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase ........................................................ 28 2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase ................................................................................................ 30 2.2.4 Tinh sạch enzyme ................................................................................ 32 2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 33 2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase ....................................... 34 2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 35 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử ...................................................... 36 2.2.9 Xử lý số liệu ........................................................................................ 41 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 42 3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO ........................................................ 42 3.1.1 Tuyển chọn .......................................................................................... 42 3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA .............. 43 3.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE .... 45 3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian ......................... 45 3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................ 47 3.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ............................................ 48 3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon ...................... 50 3.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen ................. 52 3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu .......................................................... 54 3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE ............................................................ 55 3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 ................................ 55 3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE ........................................ 56 3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE ................. 57 3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất .......................................................... 57 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu ..................................................................... 58 3.4.3 pH phản ứng tối ƣu .............................................................................. 60 3.4.4 Độ bền nhiệt độ ................................................................................... 61 3.4.5 Độ bền pH ........................................................................................... 63 3.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ......................................................... 64 3.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại................................................................. 65 3.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa ...................................................... 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 71 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 79 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ................................. 25 Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ..................... 26 Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ......................... 27 Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein ............................................... 33 Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori ............................... 43 Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 79 Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian .......................... 79 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................... 80 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................... 80 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ................................................................ 50 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô ............................................................ 80 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen ............................................................. 52 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate .......................................... 81 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu ................................ 81 Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 ....... 81 Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE ............ 82 Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 57 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase ............. 82 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .......... 82 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .... 83 Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase ..................................................... 83 Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase ............................................................. 84 Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase ...................................... 85 Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase............ 86 Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại ................................................................ 66 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase ........ 86 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase ........................ 3 Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng vi sinh vật .................................................................................................... 8 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của Cel12A từ H. grisea ......................................................................................... 9 Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea ............................. 10 Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase ............................................................................. 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose............................................................... 30 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33 Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn ........................................ 36 Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu ............. 42 Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (C). ................................................................................................. 44 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................... 45 Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................................................................... 46 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 48 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .................................................................... 49 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 51 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .............................................. 53 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 54 Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 ............................... 56 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel polyacrylamide....... ............................................................................................... 57 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 58 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 60 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 61 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 62 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 63 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian ................................................................ 64 Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 65 Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 68 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 1 MỞ ĐẦU Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide. Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ƣu của các enzyme. Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu cơ và xử lý môi trƣờng là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nƣớc hiện nay chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta là một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4- glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo-β-1,4- glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết -1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác. Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39]. Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự k