Luận văn Vai trò của auxin trong sự phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân cây đậu vigna angularis (willd) ohwi et ohashi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS ( WILLD.) OHWI ET OHASHI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS ( WILLD.) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. BÙI TRANG VIỆT TS. LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn sinh lí thực vật của trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Đại học Sư phạm- Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn và giúp đỡ của Quý Thầy Cô. Để hoàn thành luận văn này, em chân thành gởi lời cảm ơn đến: Thầy hướng dẫn PGS. TS. Bùi Trang Việt đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian làm luận văn. Cô hướng dẫn TS. Lê Thị Trung đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cũng như tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện các thí nghiệm cho luận văn. Em xin chân thành cảm ơn cô TS. Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS. Trần Thị Thanh Thủy, cô TS. Trần Thị Cúc, cô TS. Nguyễn Thị Mong, thầy TS. Phạm Văn Ngọt, thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ đã giảng dạy trong suốt thời gian em học tập tại trường. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô ở Bộ môn sinh lí thực vật trường ĐHKHTN: cô TS. Trần Thanh Hương, Thầy ThS. Phan Ngô Hoang, cô ThS. Trịnh Thị Cẩm Tú, cô ThS. Trần Thanh Hiền và em Hồ Thị Mỹ Linh quản lí phòng thí nghiệm trường ĐHSP đã cho em mượn dụng cụ và hóa chất để thực hiện thí nghiệm. Cảm ơn BGH trường THPT Nguyễn Văn Linh dã giúp đỡ để tôi có thời gian hoàn thành chương trình học. Xin gởi lời cảm ơn đến các bạn lớp sinh học thực nghiệm khóa 19, khóa 20, các bạn bè đồng nghiệp và các em sinh viên ở phòng bộ môn sinh lí thực vật. Cuối cùng, con xin nói lời cảm ơn vô hạn với bố mẹ, người đã cố gắng nuôi dưỡng và dạy dỗ để con có thể được học tập và trưởng thành. Chị và Nhiên ơi cho em bày tỏ lòng biết ơn tới hai người nhé, đã có những hi sinh nhất định để em có thể thực hiện ước mơ làm cô giáo. Cảm ơn bé Trinh đã nấu cơm cho chị trong suốt năm qua. Cảm ơn anh luôn ở bên em, yêu thương và chia sẽ với em trong cuộc sống. Tp. HCM, tháng 8 năm 2011 Nguyễn Hồ Dịu Thắm MỤC LỤC 4TLỜI CẢM ƠN4T ...................................................................................................................... 3 4TMỤC LỤC4T ............................................................................................................................ 4 4TDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT4T .................................................................................. 7 4TLỜI MỞ ĐẦU4T ...................................................................................................................... 1 4TCHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU4T ............................................................................. 2 4T1. 1. Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4T .............................................................. 2 4T1. 1.1. Phân loại4T ................................................................................................................................... 2 4T1. 1. 2. Đặc điểm sinh học4T .................................................................................................................... 2 4T1. 1. 3. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới4T............................................................. 4 4T1. 1. 4. Thành phần hóa học4T ................................................................................................................. 4 4T1. 1. 5. Giá trị thực phẩm và giá trị dược liệu4T ....................................................................................... 4 4T1. 1. 6. Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4T ................................................... 5 4T1.2. Sự phát sinh hình thái4T ........................................................................................................................ 6 4T1. 2. 1. Định nghĩa 4T ............................................................................................................................... 6 4T1. 2. 2. Phương pháp nghiên cứu4T .......................................................................................................... 6 4T1. 2. 3. Sự phát sinh rễ4T ......................................................................................................................... 7 4T1. 3. Vai trò các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái4T ....................................... 9 4T1. 3. 1. Vai trò của auxin trong sự tăng trưởng thực vật 4T ....................................................................... 9 4T1. 3. 1. 1. Sinh tổng hợp và vận chuyển auxin4T .................................................................................. 9 4T1. 3. 1. 2. Auxin trong sự phát triển rễ4T .......................................................................................... 10 4T1. 3. 1. 3. Auxin trong sự sinh trưởng, phân chia và phân hóa tế bào 4T.............................................. 11 4T1. 3. 2. Vai trò của giberelin trong sự tăng trưởng thực vật 4T ................................................................ 11 4T1. 3. 2. 1. Sự phát hiện4T ................................................................................................................... 11 4T1. 3. 2. 2. Nơi tổng hợp và di chuyển4T ............................................................................................. 12 4T1. 3. 2. 3. Tác dụng sinh lí4T ............................................................................................................. 12 4T1. 3. 3. Vai trò của Citokinin trong sự tăng trưởng thực vật 4T .............................................................. 13 4T1. 3. 3. 1. Sự phát hiện4T ................................................................................................................... 13 4T1. 3. 3. 2. Nơi tổng hợp4T ................................................................................................................. 13 4T1. 3. 3. 3. Tác dụng sinh lí4T ............................................................................................................. 13 4T1. 3. 4. Vai trò của axit abcisic (AAB)4T ............................................................................................... 14 4T1. 3. 5. Vai trò của Etilen4T ................................................................................................................... 15 4TCHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP4T .................................................................... 16 4T2.1. Vật liệu4T ........................................................................................................................................... 16 4T2. 2. Phương pháp4T .................................................................................................................................. 16 4T2. 2. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 16 4T2. 2. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro4T .............................................................................................. 17 4T2. 2. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro4T ......................... 17 4T2. 2. 4. Khảo sát ảnh hưởng của auxin trong sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis4T........................................................................................................................... 17 4T2. 2. 5. Ảnh hưởng của auxin lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis4T ................................................................................................................................. 18 4T2. 2. 6. Ảnh hưởng của auxin ở các nồng độ cao lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis4T ...................................................................................................... 18 4T2. 2. 7. Khảo sát sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin4T ........................................................................................................................................... 19 4T2. 2. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4T .................................... 19 4T2. 2. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây Vigna angularis 7 ngày tuổi4T .......................................................................................................................................................... 19 4T2. 2. 10. Đo cường độ hô hấp4T ............................................................................................................. 19 4T2. 2. 11. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 4T ............................................................. 19 4T2. 2. 12. Xử lý thống kết quả thu được4T ............................................................................................... 20 4TCHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN4T ......................................................................... 21 4T3.1. Kết quả4T ............................................................................................................................................ 21 4T3. 1. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 21 4T3. 1. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro4T .............................................................................................. 21 4T3. 1. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên chiều cao và khả năng tạo rễ của cây con in vitro4T ..... 23 4T3. 1. 4. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis4T........................................................................................................................... 25 4T3. 1. 5. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi.4T .............................................................................................................. 30 4T3. 1. 6. Ảnh hưởng của auxin ở nồng độ cao lên sự phát sinh rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi.4T .............................................................................................................. 35 4T3. 1. 7. Khảo sát sự hình thành rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi theo thời gian dưới ảnh hưởng của cùng nồng độ auxin.4T ..................................................................... 37 4T3. 1. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4T .................................... 38 4T3. 1. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây đậu Vigna angularis4T .......... 39 4T3. 1. 10. Sự thay đổi cường độ hô hấp và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở cây Vigna angularis4T ............................................................ 40 4T3. 2. Thảo luận4T ....................................................................................................................................... 41 4T3. 2. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 41 4T3. 2. 2. Ảnh hưởng của AIA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro4T ...................................... 41 4T3. 2. 3. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn hình thành và phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp4T ....................................................................................................................................... 42 4T3. 2. 4. Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin 5mg/l4T ................................................................................................................................................. 44 4T3. 2. 5. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin4T ............................................................................... 44 4T3. 2. 6. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao cây và diện tích lá4T ............................................. 44 4T3. 2. 7. Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển rễ bất định4T ......................................................................................................................................... 45 4TCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ4T ......................................................................... 46 4T .1. Kết luận4T ........................................................................................................................................... 46 4T . 2. Đề nghị4T .......................................................................................................................................... 46 4T ÀI LIỆU THAM KHẢO4T ................................................................................................. 47 4TPHỤ LỤC4T ............................................................................................................................. 1 4TPHỤ LỤC 14T .......................................................................................................................... 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisic acid. BA : Benzyl adenin. CĐHTTTV : chất điều hòa tăng trưởng thực vật. GAR3 R: Gibberellin. IAA : Indole-3-acetic acid. MS : Murashige và Skoog. TLT : trọng lượng tươi. LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ giai đoạn đầu khi con người biết trồng trọt, họ đã có ý thức chọn lọc các cây trồng mang những đặc tính có lợi cho con người. Quá trình chọn lọc như thế phải mất nhiều thời gian, hàng chục hoặc hàng trăm năm nhưng không mang lại hiệu quả cao. Đến đầu thế kỉ XX, sinh học đạt được nhiều thành tựu lớn như khám phá ra định luật di truyền Mendel, hiện tượng di truyền liên kết của Morgan và những nghiên cứu khác nữa, nhờ đó tạo ra cây trồng mang biến dị tổ hợp của nhiều gen có lợi. Và rồi kĩ thuật gây đột biến ra đời đã góp phần tạo ra nhiều giống mới có các đặc tính quý. Ngày nay chất lượng cuộc sống gia tăng, thị hiếu con người phong phú, nhu cầu về lương thực, thực phẩm lớn. Làm sao nhân nhanh nhiều giống hay tạo ra nhiều giống mới nhằm đáp ứng thị hiếu và nhu cầu con người là vấn đề lớn đặt ra cho các nhà chọn lọc và tạo giống vật nuôi và cây trồng. Phát sinh hình thái là cơ sở cho vi nhân giống thực vật nên rất được thế giới và nước ta quan tâm. Việc phát hiện auxin là chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã mở ra cho những nghiên cứu trồng trọt đầy hấp dẫn. Auxin kích thích khúc cắt hình thành rễ bất định là bước đột phá lớn cho nhân giống thực vật ( Environ, 2007 ). Đề tài “Vai trò của auxin trong sự phát sự phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi” được thực hiện nhằm tìm hiểu về các giai đoạn phát triển rễ bất định in vitro ở cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi dưới ảnh hưởng của auxin để bổ sung kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu và giảng dạy. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1. Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1. 1.1. Phân loại Giới : Plantae Ngành : Angiospermae Lớp : Dicotiledoneae Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Chi : Vigna Loài : Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng Hộ, 1999). 1. 1. 2. Đặc điểm sinh học Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi là cỏ nhất niên, thân đứng hay leo, cao 50 đến 80 cm, nhánh có cạnh, có lông dài. Bộ nhiễm sắc thể 2n = 22. Cuống 10 đến 12 cm, có lông, lá phụ xoan, đầu tròn, có thùy, dài 6 đến 8 cm, gân phụ 4 đến 5 cặp, lá bẹ thon, hình lọng, cao 8 mm. Chùm ở nách lá, dài 3 đến 10 cm, đài 5 răng ngắn; vành vàng, cao 15 mm, lườn xoắn 360 ( Phạm Hoàng Hộ, 1999 ). Hoa có màu vàng nhạt với những cánh hoa màu vàng chanh xếp thành từng cặp. Quả hình trụ, dài 5 đến 8cm, rộng 8 đến 10mm, không có lông, chứa 6 đến 10 hạt. Hạt có hình thuôn, hai đầu vuông, không có lông, dài 4 đến 7mm , đường kính 5mm, màu nâu sẫm ( Hu, 2005 ) Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi có thể được giữ ít nhất 5 năm nếu độ ẩm hạt là 13% và độ ẩm không khí 15%. Hạt nẩy mầm trên đất ở nhiệt độ 6 đến 10 P0PC nhưng tốt nhất là 30 đến 34 P0PC. Sau khi trỉa 7 đến 20 ngày cây mầm mới nhô lên khỏi mặt đất. So với các đậu khác, Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi phát triển rất chậm nên cần làm sạch cỏ giữa giai đoạn nảy mầm và ra hoa (Brink và Belay, 2006). Hình 1.1. Một số bộ phận chính của cây : a. nhánh; b. hoa; c.đài; d. nhụy; e. nhị; f.quả; g. hạt (Nguồn: Hu, 2005). Hoa kéo dài 30 đến 40 ngày. Cây tự thụ phấn nhưng vẫn có thể xảy ra thụ phấn chéo. Thời gian sinh trưởng khoảng 60, 80, 90 hoặc120 ngày. Rễ cây cộng sinh với vi khuẩn Bradyrhizobium nên có khả năng cố định N hơn 100kg N/ ha, con số này còn phụ thuộc vào độ ẩm và pH của đất (Brink và Belay, 2006). Vigna angularis sống tốt nhất ở vùng có khí hậu ấm áp và cận nhiệt đới với lượng mưa trung bình hằng năm 500 đến 1750 mm, và nhiệt độ từ 15 đến 30P0PC. Cây có thể chịu được nhiệt độ cao nhưng rất nhạy cảm với sương mù. Ở nhiệt đới, Vigna angularis thích hợp ở vùng cao và độ pH của đất từ 5 đến 7,5 (Brink và Belay, 2006). Ở Trung Quốc, Vigna angularis thường được trồng xen với ngô hoặc kê, còn ở Nhật thì luân canh xen vụ với khoai tây, củ từ hay lúa mì. Vigna angularis thường bị nhiễm bệnh do nấm, vi khuẩn hay do côn trùng tấn công như Erysiphe polygoni, Xanthomonas campestris, Matsumuraeses phaseoli Quả đậu không dễ vỡ nên người ta có thể thu hoạch bằng máy gặt. Thông thường, người ta cắt bằng tay sau đó phơi nhiều ngày trước khi xếp thành đống khô. Khi độ ẩm hạt còn 16% thì tiến hành đập. Nhiều trái đậu có vỏ mỏng, hạt lại ẩm ướt nên đã nảy mầm bên trong vỏ quả. Sản lượng hạt thu hoạch trên một ha có thể đạt đến 3500kg. Ở Kenya, người ta trồng thí nghiệm và đã thu được khoảng 500 đến 600 kg trên ha (Brink và Belay, 2006). 1. 1. 3. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới Vigna angularis được trồng ở vùng châu Á nhưng nguồn gốc của nó thì chưa được biết (Ohashi và Tahashahi, 1981). 2TViệc thuần hóa 2TVigna angularis 2Tđược biết tới từ thời xa xưa ở Hàn Quốc2T, Trung Quốc và Nhật, sau đó 2Tcây trồng này 2Tđược giới thiệu tới nhiều quốc gia khác trên thế giới. Tại Châu phi, Vigna angularis được trồng thí nghiệm ở Congo, Kenya và Angola. Khó có thể ghi lại số liệu sản lượng đậu Vigna angularis trên toàn thế giới vì nó được thống kê cùng với các loại đậu khác: Trung Quốc (470,000 ha), Nhật (60,000 ha), Hàn Quốc (25,000 ha) và Đài Loan (15,000 ha). Từ 1996 đến 2000, Nhật sản xuất hằng năm từ 70000 đến 90000 tấn, trong đó khoảng 80 đến 85% sản lượng này được thu hoạch từ phía bắc quần đảo Hokkaido5T.5T Tuy nhiên, mỗi năm Nhật Bản tiêu thụ 140.000 tấn nên phải nhập khẩu đậu từ các quốc gia như Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan và Canada. Vào những năm của thập niên 90, Trung Quốc hằng năm xuất khẩu trung bình 20.000 đến 40.000 tấn. Gần đây, Trung Quốc và Úc đã hợp tác nghiên cứu về v