Luận văn Xác định hàm lượng Cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể của gà ri, gà ác, gà tre

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ................ ................... VŨ THỊ NHƢ TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁNH TRÌNH TƢ̣ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ................ ................... VŨ THỊ NHƢ TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE Chuyên ngành : SINH HỌC THƢ̣C NGHIỆM Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS. TS Nguyễn Trọng lạng THÁI NGUYÊN, 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi . Các kết quả , số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác . Tác giả luận văn Vũ Thị Nhƣ Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của PGS .TS Nguyễn Trọng Lạng trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này . Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , phòng thí nghiệm của Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phòng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và một số gia đình ở Cao Thượng - Tân Yên - Bắc Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tình trong việc nghiên cứu t hực nghiệm của đề tài. Cuối cùng tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban giám hiệu, Khoa Sau đại học , Ban chủ nhiệm Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bản luận văn này . Tác giả Vũ Thị Nhƣ Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nhƣ̃ng tƣ̀ viết tắt DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate bp Base pair EDTA Ethylene diamine tetra – acetic acid EtBr Ethidium bromide Kb Kilo base PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris- acetate-EDTA COI Cytochrome oxidase I PBS Phosphate Buffer Saline epp eppendorf Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Danh mục các bảng Bảng Tên bảng Trang 2.1 Kết quả c hiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau 20 3.1 Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 32 3.2 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33 3.3 Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so với gà Ri 43 3.4 Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 43 3.5 Hệ số tương đồng về tr ình tự nucleotide vùng D -loop ở mẫu nghiên cứu với một số mẫu trên GenBank 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Danh mục các hình Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc hoá học của cholesterol 6 1.2 Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus 12 2.1 Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak chuẩn cholesterol 20 2.2 Đường chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak chuẩn cholesterol 21 3.1 Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33 3.2 Kết quả điện di DNA tổng số 35 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 36 3.4 So sánh trình tự đoạn D -loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 41 3.5 Quan hệ di truyền của một số giống gà 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục các bảng Danh mục các hình Mở đầu .......................................................................................................... 1 1.Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm ................................................................................. 3 1.1.1 Gà Á ............................................................................................. 4 1.1.2 Gà Ri............................................................................................. 5 1.1.3 Gà Tre. .......................................................................................... 6 1.2 Cholesterol .............................................................................................. 6 1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà ............................. 6 1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người ......................................................... 7 1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể ..................................................... 7 1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường. .......................................................................................................... 8 1.3 Đặc điểm DNA ty thể .............................................................................. 10 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể ............................... 10 1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể ...................................... 11 1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà....................................... 12 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam ........... 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới ........................ 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ........................ 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu .................................................................................................. 18 2.1.1 Nguồn gốc mẫu ........................................................................... 18 2.1.2 Địa điểm thí nghiệm .................................................................... 18 2.2 Hoá chất và thiết bị ................................................................................. 18 2.2.1 Hóa chất ....................................................................................... 18 2.2.2 Thiết bị sử dụng .................................................................... 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 19 2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol ................ 19 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử ..................................................... 22 2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật ......... 22 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................. 25 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR ............... 26 2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................... 29 2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA. ................................... 31 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 31 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu .................. 33 3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu ............................................................... 35 3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ........................... 35 3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ............................. 36 3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ........... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận .................................................................................................... 48 2. Đề nghị ..................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................. 50 PHỤ LỤC .............................................. 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 Mở đầu 1. Đặt vấn đề Hiện nay, ngành chăn nuôi có những bước phát triển mạnh mẽ với xu hướng chăn nuôi theo con đường công nghiệp hoá. Đặc biệt, ngành chăn nuôi gia cầm đang được quan tâm hàng đầu vì nó có khả năng cung cấp một lượng lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với nhu cầu của tuyệt đại đa số người dân. Sự phát triển nhanh chóng của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loại hình...chăn nuôi. Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trung với quy mô lớn tăng lên. Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩm chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi cao với nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu khắc nghiệt. Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất và tinh thần của con người được nâng cao. Chất lượng bữa ăn trong gia đình đã được cải thiện rất nhiều. Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đã mắc rất nhiều bệnh khác nhau. Trong đó, một trong những bệnh điển hình khi chất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não... Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nước phát triển thuộc thế giới tây phương. Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tới nhưng căn bệnh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là do hàm lượng cholesterol trong cơ thể cao. Khi chế độ ăn uống thay đổi thì hàm lượng cholesterol cũng thay đổi theo. Những nguồn thực phẩm giàu cholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục, não, tim, lòng đỏ trứng... Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình. Trong trứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao. Có nhiều loại trứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt... Mỗi giống gà khác nhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau. Như vậy việc lựa chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích của mỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng. Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi muốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D- loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà. - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của 3 giống gà. - Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre. - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác, gà Tre. + Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên. + Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR. + Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gà trên. - Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một số giống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết luận rằng: gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về đặc điểm hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập tính hoạt động. Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu: Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn. Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ. Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu đỏ, mỏ tương đối ngắn. Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay. Theo Nguyễn Ân (1983) [1], vị trí của gà nhà được sắp xếp trong hệ thống giới động vật như sau: Giới động vật (Animal) Ngành động vật có xương sống (Chordata) Lớp chim (Aves) Bộ gà (Galliformes) Họ Trĩ (Fasianidea) Chủng Gallus (giống gà Bankip ) Loài Gallus gallus. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước Anh, sau đó là Mỹ, các giống gà này được lai tạo thành nhiều giống gà có năng suất cao hơn. Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo, gà Vàng … 1.1.1 Gà Ác Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson. Đây là loại gà cỡ nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng như các giống gà khác, lông trắng mượt, toàn bộ da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có 5 ngón. Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long và miền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữa nhiều bệnh, nhưng không ai dám nuôi tràn lan vì khả năng cho thịt thấp mà giá thành lại cao. Nhưng cuộc sống ngày càng đi lên, những đặc sản quý mới được biết hết giá trị của nó. Gà Ác đã được nuôi nhiều ở miền Trung và miền Bắc như Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng Yên...Lúc này thì người nuôi mới thấy rằng đây là giống gà nhanh nhẹn, chăm chỉ chịu khó nhặt nhạnh kiếm mồi, chịu lạnh tốt và có sức sống cao. Như thế có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh (nuôi chuồng) đều được cả. Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác rất giàu axit amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit. Trứng của chúng tuy nhỏ (chỉ khoảng 29-30 g) nhưng tỉ lệ lòng đỏ lại rất cao, đến 34,2% [12]. Theo y học cổ truyền, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, không độc, có tác dụng bổ dưỡng cao. Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 lưng, ra mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, rất tốt cho người ốm dậy và sau khi sinh. Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công trên gà Ác để tạo ra giống gà cho nhiều trứng trong thời gian sớm nhất. Theo PGS.TS Trịnh Công Thành, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, đây là lần đầu tiên người ta áp dụng biện pháp thụ tinh nhân tạo trên giống gà Ác giữa dòng gà Ác có lông chân và dòng gà Ác không có lông chân. Kết quả, qua 5 thế hệ chọn lọc và tạo dòng, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 2 dòng gà Ác mới là gà Ác có lông chân và gà Ác không có lông chân cho sản lượng trứng cao (38/100 con cho trứng) mà trước kia là 29/100 con cho trứng). 1.1.2 Gà Ri Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta chiếm 70% tổng số gà trong nước, có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus gallus. Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có răng cưa, mào đỏ tươi rất phát triển ở con trống; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng. Cổ thanh dài vừa phải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có khi xen lẫn màu đỏ tươi. Bàn chân có 4 ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống. Màu lông khác nhau ở con mái và con trống. Con mái có màu lông màu vàng rơm, vàng đất, nâu nhạt và đốm. Con trống có màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh và lông đuôi, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất. Ngoài ra còn có màu lông khác như lông trắng, hoa mơ, đốm trắng... Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh. Gà Ri đẻ trứng sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi. Sản lượng trứng của gà mái trong một năm từ 80-120 quả. Khối lượng trứng bình quân là 38 – 42 g. Gà Ri có khối lượng cơ thể ở tuổi trưởng thành như sau: con trống từ 1,800 g đến 2,500 g, con mái từ 1,300 g đến 1,800 g. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Đây là giống gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn nuôi quảng canh ở nước ta. Gà chịu khó kiếm ăn khi nuôi trong điều kiện chăn thả trong vườn hay ngoài đồng. Hàng ngày người nuôi chỉ phải cho ăn rất ít, một vài nắm thóc vãi cho cả đàn khi gọi chúng về chuồng, ngoài ra chúng tự kiếm đủ khi được thả ngoài vườn [4], [7], [8]. 1.1.3 Gà Tre Là giống gà địa phương được nuôi ở một số tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam. Kích thước của gà nhỏ con, gà trống có lông màu trắng, đuôi và cổ đen. Gà mái màu vàng, thấp chân. Gà trống và gà mái nhỏ hơn gà Ri. Gà Tre có tập tính là hay bay và đậu trên hàng rào. Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh. Trong những năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồn quỹ gen của các loại gia cầm của nước ta. 1.2 Cholesterol 1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiều trong mỡ và có thể tạo este với axit béo, nó không thể tan và không di chuyển ở dạng tự do ở trong máu. Cholesterol có công thức cấu tạo như sau: Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của cholesterol Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cơ bản của cholesterol là nhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA và một phần phân tử của cholesterol là rượi cồn (alcohol). Cholesterol có ở nhiều loại thực phẩm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 khác nhau như nội tạng động vật: tim, gan... và đặc biệt trứng gà là loại thực