Mức độ tồn lưu của malachite green và leucomalachite trong nguyên liệu cá tra

i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BÙI THỊ THU CÚC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2009 MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA ii TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BÙI THỊ THU CÚC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.S VƯƠNG THANH TÙNG 2009 MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA iii Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA” do sinh viên Bùi Thị Thu Cúc thực hiện và báo cáo ngày 16 tháng 07 năm 2009, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Luận văn đã chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng và được giáo viên hướng dẫn xét duyệt. Cần Thơ, ngày 19 tháng 07 năm 2009 Cán bộ hướng dẫn Th.S Vương Thanh Tùng i LỜI CẢM TẠ Luận văn là bước đánh giá cuối cùng của quá trình học tập, rèn luyện một sinh viên trong môi trường đại học. Thực hiện tốt luận văn không chỉ nhờ sự cố gắng bản thân mà còn nhờ nhiều vào sự giúp đỡ từ thầy cô cán bộ. Để hoàn thành được đề tài luận văn này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Vương Thanh Tùng đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện. Ghi lòng biết ơn đến cô cố vấn học tập Lê Thị Minh Thủy vì đã hết lòng giúp đỡ không chỉ trong đợt luận văn mà còn trong suốt khóa học. Chân thành cảm ơn đến thầy cô giảng dạy bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến đã truyền đạt những kiến thức quý báu và bổ ích. Cảm ơn đến chị Lương Diễm Trang học viên cao học K13 và anh Nguyễn Thanh Phong cán bộ phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ thực hiện các thao tác thực nghiệm cho tôi hoàn thành đề tài. Cám ơn cha mẹ và gia đình đã quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài này. Gởi lời cảm ơn và chúc thành công đến tất cả các bạn lớp Chế Biến Thủy Sản K31, những người luôn giúp đỡ tôi trong khi thực hiện đề tài. Cần Thơ, tháng 05 năm 2009 Sinh viên thực hiện Bùi Thị Thu Cúc ii TÓM TẮT Trong tình hình hiện nay, xuất khẩu thủy sản của nước ta phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng hóa chất, kháng sinh trong thủy sản. Dư lượng các hóa chất, kháng sinh còn tồn đọng trong thủy sản rất có hại đối với sức khỏe con người và nền kinh tế nước nhà. Vì vậy, việc xác định “mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong nguyên liệu cá tra” được thực hiện nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong cá tra. Đề tài bao gồm hai thí nghiệm: Thí nghiệm (1) Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tươi bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ. Từ đó, có thể chọn ra một phương pháp cho hiệu suất tốt nhất để tiến hành thí nghiệm (2) xác định mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite green trong cá tra. Thí nghiệm (2) cá được gây nhiễm hai lần gồm ba nồng độ MG gây nhiễm: 0,1 ppm, 0,15 ppm và 0,2 ppm với 9 mức thời gian thu mẫu: trước khi gây nhiễm T0, sau gây nhiễm lần 1: 6 giờ (T1), 72 giờ (T2). Sau gây nhiễm lần 2: 6 giờ (T3), 72 giờ (T4), 7ngày (T5), 14 ngày (T6), 28 ngày (T7), 56 ngày (T8). Chất phân tích sau khi chiết tách được xác định bằng LC-MS. Kết quả cho thấy phương pháp 2 là phương pháp tốt nhất với hiệu suất đạt và chọn làm thí nghiệm (2). Ở thí nghiệm (2) nồng độ MG tìm thấy trong cơ và da cá khi gây nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều giảm xuống sau 72 giờ gây nhiễm lần. Hàm lượng MG phát hiện trong cá ở nghiệm thức 0,1 ppm và 0,15 ppm cho thấy sau 28 ngày gây nhiễm nồng độ MG thấp hơn mức ấn định dư lượng tối đa của MG và LMG (không được vượt quá hai phần tỉ (ppb)) trong sản phẩm thủy sản của các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu Châu và Úc Châu (Quyết định số 2002/657/EC ngày 22/12/2003). Sau 56 ngày sau gây nhiễm thì nồng độ MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra với nồng độ thấp (0,31-2,42 ppb). iii CÁC TỪ VIẾT TẮT MG Malachite green LMG Leucomalachite green MW Molecular Weight MF Chemical Formula ppb Parts per billion ppm Parts per million ng Nanogram µm Micrometer HPLC High pressure Liquid chromatography MS Mass spectrometry LC-MS Liquid chromatography- Mass spectrometry EU Thị trường Châu Âu BTS Bộ Thủy Sản GDP Gross Domestic Product ACN Acetonitrile HA Hydroxylamine.HCl DEG Diethylene glycol TSA p-toluen sulfonic acid monohydrate TMPD N,N,N,N-tetramethyl- 1,4- phenilenediamine dihydrochloride iv DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ....................................................................15 Hình 3.2: Hệ thống cô quay chân không.............................................................18 Hình 3.3: Qui trình li trích MG ở phương pháp 1 ...............................................19 Hình 3.4: Thiết bị li tâm lạnh..............................................................................22 Hình 3.5: Bình chiết ...........................................................................................23 Hình 3.6: Qui trình li trích MG ở phương pháp 2 ...............................................24 Hình 3.7: Qui trình li trích MG ở phương pháp 33.2.3 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra..........................................................27 Hình 3.8: Bể nuôi ...............................................................................................29 Hình 3.9: Sơ đồ bố trí nghiệm xác định mức độ tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá tra ...............................................................................................30 Hình 4.10: Đồ thị đường chuẩn ..........................................................................33 Hình 4.11: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm .....................37 Hình 4.12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm..........................................40 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Tín hiệu trên máy LC-MS đọc được ứng với nồng độ chuẩn ...................33 Bảng 4.2: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn MG, LMG 39 ppb..............34 Bảng 4.3: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG và LMG ..........35 Bảng 4.4: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG, LMG ...............36 Bảng 4.5: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm ..............................37 Bảng 4.6: Sự tồn lưu của MG theo thời gian thí nghiệm .................................................39 Bảng 4.7: Sự tồn lưu của LMG theo thời gian thí nghiệm ..............................................40 vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................... I TÓM TẮT.......................................................................................................... II CÁC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................................III DANH SÁCH HÌNH......................................................................................... IV DANH SÁCH BẢNG .........................................................................................V DANH SÁCH BẢNG .........................................................................................V MỤC LỤC ........................................................................................................ VI CHƯƠNG 1 ........................................................................................................ 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu.................................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................................ 1 1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................... 2 1.4 Thời gian thực hiện .............................................................................................................. 2 CHƯƠNG 2 ........................................................................................................ 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.................................................................................... 3 2.1 Tìm hiểu về malachite green............................................................................................ 3 2.1.1 Sơ lược về malachite green....................................................................................... 3 2.1.2 Tình hình sử dụng MG................................................................................................ 4 2.1.3 Các ứng dụng của Malachite green ....................................................................... 5 2.1.4 Tác hại của Malachite green..................................................................................... 6 2.1.5 Công dụng của Malachite green sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ...... 7 2.1.6 Chất thay thế malachite green............................................................. 7 2.2 Nguyên liệu cá tra................................................................................................................. 7 2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra.................................................................................... 7 2.2.2 Tình hình phát triển ngành nuôi cá tra ................................................................. 8 2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green......................................... 8 2.3.1 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong các sản phẩm cá bằng sắc kì lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) .........................................................10 2.3.2 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG bằng sắc kí lỏng (LC) với sự oxi hóa LMG .........................................................................................................................11 2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng..............................................11 2.4 Mức độ tồn lưu của chất kháng sinh ..........................................................................11 2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc và hoá chất ............................................................................................................................................12 CHƯƠNG 3 .......................................................................................................14 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................14 3.1 Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................................14 3.1.1 Địa điểm ..........................................................................................................................14 3.1.2 Nguyên vật liệu ............................................................................................................14 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ .....................................................................................................14 vii 3.2 Phương pháp thí nghiệm..................................................................................................14 3.2.1 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ..............................................................................14 3.2.2 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra .28 3.3 Xử lý số liệu ..........................................................................................................................32 CHƯƠNG 4 .......................................................................................................33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................33 4.1 Xây dựng đường chuẩn MG, LMG ............................................................................33 4.2 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ ....................................................................................33 4.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS).....................34 4.2.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS).....................35 4.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS).....................36 4.3 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống..............................................................37 4.3.1 Sự tồn lưu của MG + LMG................................................................37 4.3.2 Sự tồn lưu của MG ............................................................................39 4.3.3 Sự tồn lưu của LMG..........................................................................40 CHƯƠNG 5 .......................................................................................................42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...............................................................................42 5.1 Kết luận ..................................................................................................42 5.2 Đề xuất ..................................................................................................43 PHỤ LỤC 1 .......................................................................................................44 PHỤ LỤC 2 .......................................................................................................47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................50 1 Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Xuất nhập khẩu chiếm một vị thế quan trọng trong việc tăng tỉ trọng, tăng GDP của cả nước. Trong các mặt hàng xuất khẩu thì cá da trơn, đặc biệt là cá tra là một mặt hàng chiếm ưu thế khá lớn. Để đáp ứng nhu cầu ở các thị trường khó tính đòi hỏi mặt hàng cá tra không chỉ đảm bảo về chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, mà còn phải đảm bảo nhu cầu sức khoẻ con người. Nhưng đứng trước tình hình khá phổ biến hiện nay đó là thực trạng tồn lưu của Malachite green (MG) và Leucomalachite green (LMG) trong nguyên liệu cá tra- một loại hóa chất có tác hại rất lớn đối với sức khoẻ con người và nền kinh tế thị trường nước nhà. Như chúng ta đã biết biểu hiện gây ung thư của LMG trên chuột nhắt cái và là chất gây đột biến trong cơ thể của các loài động vật, ngoài ra MG còn là 1 hoá chất có thể gây bệnh ung thư cho con người nên đã bị cấm sử dụng và được kiểm tra nghiêm ngặt về dư lượng có trong thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới (www.thanhnien.easyvn.com). Sự kiện một số container sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu từ Việt Nam bị từ chối ở thị trường Châu Âu, Mỹ và Canada trong thời gian qua do phát hiện có dư lượng MG. Những tháng cuối năm 2004, trên 10 container cá da trơn, cá rô phi và cá trê xuất khẩu sang thị trường Châu Âu của các doanh nghiệp ở An Giang, Đồng Tháp…bị trả về do phát hiện chất MG. Chỉ riêng năm 2005, EU đã phát hiện 12 lô hàng về dư lượng MG. Tất cả lô hàng bị phát hiện đều bị trả lại Việt Nam. Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành xuất khẩu thủy sản trong nước và đời sống của người dân lao động nước ta. Việc xác định được dư lượng các chất kháng sinh còn tồn lưu trong các loài động vật thủy sản cũng đã được nghiên cứu nhiều trong và ngoài nước, nhưng sự tồn lưu MG trong cá tra, ứng với điều kiện nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thì ít được nghiên cứu. Nên những thông số về “mức độ tồn lưu Malachite green và Leucomalachite green trong nguyên liệu cá tra” rất cần thiết cho người nuôi cũng như nhà chế biến. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Thông qua việc phân tích dư luợng MG trong nguyên liệu cá tra sau các giai đoạn lây nhiễm, đề tài nhằm xác định thời gian tồn lưu của hoá chất MG 2 trong nguyên liệu cá tra. Từ đó có thêm thông tin cho các nhà nuôi trồng và chế biến trong việc hướng tới việc sử dụng hoá chất, kháng sinh hiệu quả và an toàn để nâng cao chất lượng và độ an toàn nguyên liệu cá tra trước khi đưa vào chế biến. 1.3 Nội dung nghiên cứu Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tươi bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ. Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra. 1.4 Thời gian thực hiện Từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009. 3 Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tìm hiểu về malachite green 2.1.1 Sơ lược về malachite green Các quốc gia trong khối liên hiệp Âu Châu và Úc Châu ấn định ngạch số tối đa của MG và LMG trong thủy sản là phải ở mức 2 ppb, tức là không vượt quá 0,002 mg/kg. Hoa Kỳ, Canada, cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung Quốc và Việt Nam thì không chấp nhận sự hiện diện của bất kì 1 dư lượng nào dù thật thấp của MG và LMG. 2.1.1.1 Malachite green là gì? Malachite green (còn gọi là xanh malachite) có tên khoa học là Triphenylmethane. MG là một hoá chất thường ở dạng bột mịn, có màu xanh, hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, sợi và giấy trong ngành sản xuất công nghiệp. Ngoài ra MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu, MG đươc xem là chất diệt nấm (loại saprolegnia ssp) và diệt kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa). Leuco malachite green được sinh ra từ sự khử malachite green bới các enzyme trong cá, một hợp chất chuyển hoá rất bền của MG. LMG được tích luỹ bên trong, vỗ béo cơ thịt, tồn trữ lâu dài trong cơ thịt của cá. 2.1.1.2. Công thức cấu tạo của Malachite green và Leucomalachite green. N CH3 N CH3 CH3 H3C N CH3 N CH3 CH3 H3C Cl- Reduction Oxidation - HCl Malachite green (MG) Leucomalachite green (LMG)
Malachite green, Green malaquite, Grenoble green ... Tên quốc tế (IUPAC): [4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methylidene]- 1-cyclohexa-2,5-dienylidene]-dimethyl-ammonium chloride 4 Khối lượng phân tử (MW): 364,911 Công thức phân tử (MF): C23H25N2Cl
Malachite green leuco, Leucomalachite green ... IUPAC: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl- aniline MW: 330,466 MF: C23H26N2 2.1.2 Tình hình sử dụng MG 2.1.2.1 Tình hình sử dụng MG trên thế giới Trong các thập niên qua ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới có những bước tiến vượt bậc. Do việc áp dụng kĩ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho thủy sản chết hàng loạt, vì thế người nuôi luôn tìm biện pháp khắc phục và việc sử dụng thuốc, hóa chất trong công việc phòng và trị bệnh là rất hữu hiệu. Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như 1 chất diệt nấm. Nguyên nhân là do loại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dể mua. (www.vietnam.net). Theo bộ nghề cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các trại nuôi cá Hồi và cá Chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày từ 15/9 đến 3/10/2005, cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc (NEPQIS) đã tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên cả nước và đây là lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá ở nước này. Lượng hóa