Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm beauveria và paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại ĐBSCL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số ngành: 9620112 Cần Thơ, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số ngành: 9620112 Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. TRẦN VĂN HAI Cần Thơ, 2018 ii LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận án này trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: Con xin gửi hai đấng sinh thành và những người thân yêu nhất của con lòng biết ơn về những gì mà mọi người đã làm cho con, để con có đầy đủ điều kiện học tập và nghiên cứu. PGS. TS. Trần Văn Hai đã tận tình hướng dẫn định hướng, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có cơ hội thực hiện công trình nghiên cứu này. PGS. TS. Nguyễn Văn Huỳnh đã hướng dẫn thực hiện chuyên đề trong luận án Xin gởi lời cảm ơn quý Thầy, Cô và các anh chị trong Bộ môn Bảo vệ Thực vật đã tận tình giảng dạy, chia sẻ những kiến thức quý báu, nhiệt tình hỗ trợ giúp tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này. Chân thành cảm ơn cô Trần Thị Thanh Thủy bộ môn Di truyền - Giống nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn em trong việc xử lý thống kê thí nghiệm. Gửi lời cảm ơn đến em Lê Thị Thanh Tâm đã động viên giúp đỡ tinh thần tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện luận án. Gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên Tính, Trụ, Kiều, Duy Khoa, Sỷ, Giang, Tuấn, Hóa làm việc tại phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học (NEDO) đã nhiệt tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài và tất cả những người đã từng giúp đỡ mà tôi chưa liệt kê ra hết trên trang cảm tạ này. Xin thành thật biết ơn Hội đồng bảo vệ luận văn và giáo viên phản biện đã đọc và đóng góp ý kiến quý báu để luận án được hoàn chỉnh. Chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Cần Thơ, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh HUỲNH HỮU ĐỨC iii Huỳnh Hữu Đức - “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long” Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 9.62.01.12 Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Cần Thơ, 2013 - 2017 TÓM TẮT Luận án tập trung vào các nghiên cứu cơ bản về: (1) Thu thập và định danh các loài từ chi Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử dựa trên trình tự DNA vùng ITS - rDNA; (2) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã định danh được loài; (3) Bước đầu đánh giá hiệu lực của các chủng nấm trắng Beauveria trên sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) và các chủng nấm tím Paecilomyces trên rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm; (4) Đánh giá hiệu lực của hai chế phẩm nấm Beauveria và Paecilomyces ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng trên ruộng khoai lang và vườn mãng cầu xiêm tại Vĩnh Long. Nhằm thiết lập cơ sở dữ liệu cho các chủng nấm bản địa, cung cấp thông tin cơ bản cần thiết để chọn lựa chủng nấm có độc tính cao sử dụng trong quản lý phòng trừ dịch hại cây trồng. Kết quả phân lập và định danh đã xác định 16 chủng nấm thuộc loài Beauveria bassiana và 14 chủng nấm thuộc loài Paecilomyces javanicus ký sinh trên côn trùng gây hại cây trồng tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Tản nấm của các chủng nấm B. bassiana nuôi cấy trên môi trường PDA thường có màu trắng hoặc màu trắng hơi ửng vàng khi thành thục. Các chủng nấm có đặc điểm chung bởi cuống bào tử đính mọc theo hình vòng xoắn và thành từng cụm dầy đặc của cành bào đài ngắn với một bào tử đơn có dạng hình trứng (2,61 - 2,97 x 2,35 - 2,72 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 - 2,24 μm). Đối với nấm P. javanicus màu sắc tản nấm thay đổi dần, ban đầu màu trắng sau đó chuyển sang màu kem rồi đến màu tím nhạt (xám tro) khi bào tử già, sự phân nhánh cuống bào tử đính dạng vòng không đều, mỗi vòng gồm 2 - 3 thể bình, bào tử đính có dạng hình thoi, đôi khi hình trụ. Kích thước 5,01 - 5,74 x 1,51 - 1,69 μm. Ngoài ra, kết quả phản ứng PCR với hai primer ITS4 và ITS5 đối với hai loài này đều cho sản phẩm PCR là những băng màu có kích thước 580 bp, giải trình tự so sánh mức độ tương đồng trình tự DNA vùng ITS-rDNA cho thấy các chủng nấm có sự tương đồng cao (96,6% đến 99,6%) so với những trình tự vùng ITS-rDNA của hai loài B. bassiana và P. javanicus đã công bố trên Genbank. iv Đặc điểm sinh học của 16 chủng nấm B. bassiana và 14 chủng nấm P. javanicus cho thấy: Tỷ lệ nẩy mầm của các chủng nấm P. javanicus đạt trên 94% sau 20 GSKC sớm hơn so với các chủng nấm B. bassiana đạt trên 94% sau 24 GSKC. Môi trường SDAY3 và PDA luôn cho tốc độ phát triển đường kính tản nấm nhanh và cho mật số bào tử cao, ngoài ra chủng nấm P. javanicus còn phát triển tốt trên môi trường CDA. Thời gian để các chủng nấm B. bassiana và các chủng nấm P. javanicus cho mật số bào tử cao nhất là sau 14 NSKC và đạt mật số bào tử cao khoảng 107 - 108 bt/cm2. Nhiệt độ tối hảo cho nấm B. bassiana và các chủng nấm P. javanicus phát triển đồng thời tạo nhiều bào tử là từ 25o - 28oC. Khi nhiệt độ tăng lên cao trên 30oC thì cả hai loài nấm đều phát triển chậm lại hoặc không phát triển được. Bào tử các chủng nấm B. bassiana và các chủng nấm P. javanicus có khả năng sống sót sau khi tiếp xúc với điều kiện nhiệt độ cao trong 8 giờ. Đa số thuốc hoá học trừ nấm bệnh có ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển và nẩy mầm của nấm B. bassiana và nấm P. javanicus ở nồng độ (LKC) và (2 x LKC). Trong điều kiện phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hiệu lực của các chủng nấm B. bassiana trong phòng trừ thành trùng SKL C. formicarius (Fabricius) và P. javanicus trong phòng trừ thành trùng rệp sáp P.lilacinus (Cockerell) cho thấy các chủng nấm thuộc hai loài này đều có hiệu quả cao đối với ký chủ của chúng, đạt tỷ lệ ký sinh 90% sau 11 ngày chủng nhiễm. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm B. bassiana trong phòng trừ thành trùng SKL C. formicarius (Fabricius) và chế phẩm P. javanicus trong phòng trừ thành trùng rệp sáp P. lilacinus (Cockerell) ở điều kiện PTN và nhà lưới thì cả hai chế phẩm đều đạt hiệu quả cao trên 80% sau 7 - 11 ngày phun chế phẩm với mật số bào tử chế phẩm từ 108 - 109 (bt/mL) và liều lượng chế phẩm từ 3,0 kg và 3,5 kg. Kết quả đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm B. bassiana và P. javanicus trên diện hẹp ở điều kiện ngoài đồng ruộng cho thấy, khi phun 5 lần chế phẩm nấm B. bassiana để phòng trừ SKL và 3 lần chế phẩm P. javanicus để phòng trừ rệp sáp với liều lượng 3,0 kg/ha cho hiệu quả tương đương với biện pháp sử dụng thuốc hoá học theo nông dân. Vì vậy, các kết quả thu được trong nghiên cứu này là cơ sở để khuyến cáo ứng dụng nấm ký sinh B. bassiana và P. javanicus như một tác nhân kiểm soát sinh học trong các chương trình IPM, để thay thế các loại thuốc hóa học cũng là cơ sở cho hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực đấu tranh sinh học côn trùng. Từ khoá: Beauveria bassiana, Paecilomyces javanicus, rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell), sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) và trình tự DNA vùng ITS-rDNA. v Huynh Huu Duc - “Study on morphological, biological characteristics and efficacy of species in genus Beauveria and Paecilomyces infecting plant herbivores harmful insects in Mekong Delta” Major: Plant protection Code: 9.62.01.12 Educational organization: CanTho University, 2013 - 2017 THESIS ABSTRACT The thesis objectives of the basic experiment were: (1) to collect and identify a number of species in genus Beauveria and Paecilomyces infecting plant herbivores harmful insects by morphological characteristics and classify the genus differences among isolated Beauveria and Paecilomyces fungi based on the sequences of ITS - rDNA region; (2) to study some biological characteristics, factors affecting the growth and development of the strains of Beauveria and Paecilomyces as identified species; (3) to evaluate the efficacy of B. bassiana isolates on sweet potato weevil Cylas formicarius (Fabricius) and P. javanicus isolates on mealybug Planococcus lilacinus (Cockerell) in-vitro condition; (4) to evaluate of the efficacy of two fresh powder of B. bassiana and P. javanicus fungi inoculant in in-vitro, net house and field conditions at Vinh Long province. Results of the research were to establish a database for native fungal strains, and provide necessary basic information needed to choose the highly virulent isolates using in management of crops pest prevention. The result of the isolation and identification showed that sixteen Beauveria isolates belong to one entomopathogenic Beauveria species, Beauveria bassiana and fourteen Paecilomyces isolates belong to one entomopathogenic Paecilomyces species, Paecilomyces javanicus parasitic on insects at the Mekong Delta provinces. Colonies of strains B. bassiana on PDA medium were normally white or white to pale yellow when mature. These isolates were characterized by conidiophores consisting of whorls and dense clusters of short conidiophorous cells with one-celled ovoid (2.61 - 2.97 x 2.35 - 2.72 μm) or globose (2.24 - 2.28 x 2.23 - 2.24μm). For the colonies of strains P. javanicus changed gradually, at first white, in age becoming cream and then purple (ash gray) when mature, conidiophores forming verticillate branches with phialides in whorls of 2 to 3, conidia has fusiform shape, sometimes cylindrical shape (5.01 - 5.74 x 1.51 - 1.69 μm). In addition, The ITS4 and ITS5 primers, successfully amplified a fragment of approximately 580 bp from all Beauveria and Paecilomyces isolates, the result of the sequences of ITS - rDNA region reported that those both species Beauveria and Paecilomyces strains have a significantly considerable similarity (from 96.6% to 99.6%) compared with others on Genbank. vi The biological characteristics of 16 strains B. bassiana and 14 strains P. javanicus showed that the germination rate of strains P. javanicus was over 94% at 20 hours after cultivation, earlier than the germination rate of strains B. bassiana was over 94% at 24 hours after cultivation. The SDAY3 and PDA medium have given the quick speed of colonies diameter and high density of conidia, furthermore strains P. javanicus can grow well when P. javanicus was cultivated on CDA medium. The time for strains B. bassiana and P. javanicus gave the highest spores number at 14 days after cultivation and there are the high density of conidia about ((107 - 108 conidia) x cm-2). The optimal temperature for strains B. bassiana and P. javanicus development as well as many conidia production were about 25o - 28oC. When the temperature increased above 30oC, both B. bassiana and P. javanicus grew slowly or did not grow. The spores of B. bassiana and P. javanicus were able to survive after coming in contact with high temperature conditions during 8 hours. Almost all fungicides had effected on the growth and germination of B. bassiana and P. javanicus. In laboratory conditions, the first step evaluated the efficacy of B. Bassiana for the control of sweet potato weevil C. formicarius (Fabricius) and the efficacy of P. javanicus for the control of mealybug P. lilacinus. The results of experiments showed that all fungal strains were highly effective for their hosts and the parasitic rate was 90% at date 11th after treatment. The evaluative efficacy of parasitic fungi B. bassiana for the control of sweet potato weevil C. formicarius and parasitic fungi P. javanicus for the control of mealybug P. lilacinus were carried out in laboratory and nethouse conditions. The results of using parasitic fungi B. bassiana and P. javanicus showed that two parasitic fungi showed high effect over 80% after 7 - 11 days following treatment of fresh powder fungi preparation with the concentration of spores from 108 to 109 conidia/mL and the dose of fresh powder fungi inoculant from 3.0 to 3.5 kilograms/ha. The results evaluated the efficacy of parasitic fungi B. bassiana and P. javanicus when experiments were carried out in the field, were sprayed five times by fresh powder fungi inoculant B. bassiana for the control of C. formicarius were spayed for the control of P. lilacinus with the dose of fresh powder fungi preparation from 3.0 kilograms/ha, the results of all experiments gave equivalent effects with using chemistry by famers’ methods. Therefore, collected data in this research, which is the basis to recommend for applying successfully entomopathogenic fungi as a biocontrol agent in the IPM programmes. Key words: Beauveria bassiana, mealybug Planococcus lilacinus (Cockerell) Paecilomyces javanicus, sweet potato weevil Cylas formicarius (Fabricius) and sequences of ITS - rDNA region. vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................... ii TÓM TẮT .................................................................................................................... iii THESIS ABSTRACT ................................................................................................... v MỤC LỤC .................................................................................................................. vii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... x DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. xiii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. xvi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU......................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu .................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ................................................................................ 4 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................................. 4 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ........................................................................... 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 6 2.1. Tổng quan tài liệu về hai chi nấm Beauveria và Paecilomyces ............................... 6 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu ..................................................................................... 6 2.1.2. Phân bố địa lý và sinh thái của nấm ký sinh côn trùng .............................. 7 2.1.3. Hệ thống phân loại của hai chi Beauveria và Paecilomyces ...................... 8 2.1.4. Vòng đời của Hypocreales và Entomophthorales ...................................... 9 2.1.5. Phương pháp phân lập và định danh nấm ký sinh côn trùng.................... 11 2.1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Beauveria và Paecilomyces ......................................................... 20 2.1.7. Sản xuất chế phẩm và công thức phối trộn............................................... 27 2.1.8. Sự suy giảm tính độc của nấm ký sinh ..................................................... 27 2.1.9. Khả năng phòng trừ sinh học của chi nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh gây bệnh côn trùng ........................................... 28 2.2. Sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) ..................................................... 40 2.2.1. Phân loại và phổ ký chủ ............................................................................ 40 2.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh học ................................................................ 41 2.2.3. Tập quán sinh sống và cách gây hại của sùng khoai lang ........................ 41 viii 2.2.4. Triệu chứng gây hại của sùng khoai lang ................................................. 43 2.2.5. Biện pháp phòng trị sùng khoai lang trên đồng ruộng ............................. 43 2.3. Rệp sáp giả (Planococcus lilacinus Cockerell) ...................................................... 44 2.3.1. Phân bố và ký chủ ..................................................................................... 44 2.3.2. Đặc điểm hình thái và sinh học ................................................................ 44 2.3.3. Tập quán sống và cách gây hại ................................................................. 45 2.3.4. Biện pháp phòng trị .................................................................................. 45 2.4. Các loại thuốc bảo vệ thực vật dùng trong nghiên cứu .......................................... 45 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................... 50 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 50 3.2. Phương Tiện Nghiên Cứu ...................................................................................... 50 3.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 52 3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 53 3.4.1. Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử .......................................................................................................... 53 3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria và Paecilomyces ....................................................................................... 56 3.4.3. Bước đầu đánh giá độc tính của các chủng nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm (PTN) ................................. 60 3.4.4. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện PTN ................................................................. 62 3.4.5. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện nhà lưới ........................................................... 65 3.4.6. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm các chủng nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và ix Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện ngoài đồng ....................................................... 66 3.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................... 72 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................