Nghiên cứu hoạt tính ức chế Enzym α- Glucosidase của một số cây thuốc ở An Giang và thành phần các hoạt chất của thân cây núc nác

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH NGỌC NGHIÊM THỤY NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α- GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC Oroxylum indicum (L.) Kurz Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 62 44 29 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.Nguyễn Thị Thanh Mai Thành phố Hồ Chí Minh-2011 Lời cảm ơn Xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, người cô đã định hướng, truyền thụ những kinh nghiệm quý báo cho tôi, người đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này. Cán bộ Nguyễn Xuân Hải, người luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi trong lúc thực nghiệm, giải đoán cấu trúc cũng như trình bày khóa luận. Cán bộ Đặng Hoàng Phú, người đã hỗ trợ tôi rất nhiều khi thực nghiệm. Cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên, chia sẻ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh 9-2011. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG ............................................................................... 1 1.1. Khái niệm ............................................................................................. 1 1.2. Phân loại ............................................................................................... 1 1.2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1 ......................................................... 1 1.2.2. Bệnh đái tháo đường loại 2 ......................................................... 1 1.3. Tác hại .................................................................................................. 3 1.3.1. Các biến chứng cấp tính ............................................................. 3 1.3.2. Các biến chứng mãn tính ........................................................... 4 1.4. Phương pháp điều trị ............................................................................. 4 2. ENZYM α-GLUCOSIDASE .............................................................................. 6 2.1. Sơ lược về enzym .................................................................................. 6 2.2. Chất ức chế enzym................................................................................. 6 2.3. Động học phản ứng xúc tác của enzym ................................................. 8 2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzym .................................................. 8 2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất nền [S] ......................................... 9 2.3.3. Ảnh hưởng của chất ức chế ...................................................... 12 2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh ....................................................... 12 2.3.3.2. Ức chế kháng cạnh tranh ............................................ 14 2.3.3.3. Ức chế không cạnh tranh ............................................ 16 - 6- 2.3.3.4. Uc chS h6n tp ........................................................... 18 3.1. Tên gọi ...................................................................................................... 30 3.2. Mô tả thực vật ........................................................................................... 31 3.3. Phân bố ..................................................................................................... 32 3.4. Dược tính .................................................................................................. 33 3.5. Thành phần hóa học ................................................................................... 33 3.5.1. Các hợp chất cô lập từ lá .................................................................. 33 3.5.2. Các hợp chất cô lập từ quả ............................................................... 34 3.5.3. Các hợp chất cô lập từ hạt ................................................................ 35 3.5.4. Các hợp chất cô lập từ vỏ thân ......................................................... 36 3.5.5. Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ ............................................................. 37 3.6. Hoạt tính sinh học ..................................................................................... 40 3.6.1. Kháng khuẩn .................................................................................... 40 3.6.2. Chống lại tác nhân gây đột biến ....................................................... 40 3.6.3. Chống ung thư ................................................................................. 40 3.6.4. Ức chế tăng sinh tế bào .................................................................... 40 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI THỰC NGHIỆM 1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ........................................................... 43 1.1. Hóa chất ................................................................................................ 43 1.2. Thiết bị .................................................................................................. 43 1.3. Dụng cụ ................................................................................................. 44 2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE ................ 44 2.1. Điều chế cao thô .................................................................................... 44 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................ 44 2.1.2.Ly trích ........................................................................................ 49 2.2. Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase ........................................... 49 2.2.1. Nguyên tắc ............................................................................... 49 2.2.2.Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase ................. 51 2.2.3.Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase ... 53 2.3. Khảo sát động học xác định kiểu ức chế và hằng số ức chế Ki ............... 53 2.3.1.Khảo sát thời gian phản ứng ................................................... 54 2.3.2.Khảo sát nồng độ chất nền ...................................................... 55 2.3.3.Xác định kiểu ức chế .............................................................. 55 2.3.4.Xác định hằng số ức chế Ki ..................................................... 57 3. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ THÂN CÂY NÚC NÁC ................................. 59 3.1. Ly trích cao thô ...................................................................................... 59 3.2. Cô lập hợp chất ...................................................................................... 60 3.2.1.Cô lập chất từ phân đoạn A ....................................................... 60 3.2.2.Cô lập chất từ phân đoạn B ....................................................... 61 3.2.3.Cô lập chất từ phân đoạn C và D ............................................... 61 KẾT QUẢ 1. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA 40 CÂY THUỐC AN GIANG .............................................................................. 65 1.1. Kết quả điều chế cao thô ................................................................. 65 1.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 40 mẫu cây . 66 2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM α- GLUCOSIDASE CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC .................................................. 69 2.1. Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất ............................................... 69 2.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất ............................................................. 72 2.2.1. Hợp chất (1) ..................................................................... 72 2.2.2. Hợp chất (2) ..................................................................... 74 2.2.10. Hợp chất (10) ................................................................. 92 2.2.11. Hợp chất (11) ................................................................. 94 2.2.12. Hợp chất (12) ................................................................. 96 2.3. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất cô lập được ................................ 98 2.4. Nghiên cứu động học ức chế enzym α-glucosidase của oroxylosid ........ 99 2.4.1. Khảo sát thời gian phản ứng ....................................................... 99 2.4.2. Khảo sát nồng độ chất nền ........................................................ 100 2.4.3. Xác định kiểu ức chế ................................................................ 101 2.4.4. Xác định Ki .............................................................................. 103 KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên Vmax và Km .............................. 20 Bảng 1.2: Sự phân loại khoa học của cây núc nác .................................................. 30 Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài .................................. 45 Bảng 2.2: Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính ................................ 52 Bảng 2.3: Thể tích các dung dịch khảo sát nồng độ chất nền ................................ 55 Bảng 2.4: Tóm tắt dạng đồ thị các kiểu ức chế ...................................................... 55 Bảng 2.5: Thể tích các dung dịch nghiên cứu động học ......................................... 57 Bảng 2.6: Tóm tắt cách xác định Ki các kiểu ức chế ............................................. 57 Bảng 3.1: Bảng hiệu suất cao trích được của các mẫu cây thuốc nghiên cứu ......... 65 Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương ................................... 66 Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang ......................... 66 Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thô ........................................................................................................................ 69 Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thu được từ cao EtOAc ......................................................................................... 70 Bảng 3.6: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d1 .................................. 73 Bảng 3.7: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d1 và hợp chất oroxylin A trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 ............ 74 Bảng 3.8: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 ...................... 76 Bảng 3.9: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất oroxylosid trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 .. 76 Bảng 3.10: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d6 ....................................... 78 Bảng 3.11: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d6 và hợp chất hispidulin trong dung môi metanol-d4 ............................... 79 Bảng 3.15: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (6) trong dung môi aceton-d6 ....................................... 86 Bảng 3.16: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (6) trong dung môi aceton-d6 và hợp chất balanophonin trong dung môi cloroform-d1 ....................... 86 Bảng 3.17: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d6 ....................................... 89 Bảng 3.18: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d6 và hợp chất 2-(1-hydroxymetyletyl)-4H,9H-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion trong dung môi cloroform-d1 ................................................................................ 89 Bảng 3.19: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (8) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất acid salicylic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 91 Bảng 3.20: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (9) trong dung môi aceton-d6 và hợp chất acid p-hydroxybenzoic trong dung môi aceton-d6 .............. 92 Bảng 3.21: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (10) trong dung môi metanol-d4 và hợp chất acid protocatechuic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 ..93 Bảng 3.22: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (11) trong dung môi cloroform-d1 và hợp chất isovanillin trong dung môi cloroform-d1 ....................... 95 Bảng 3.23: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (12) trong dung môi aceton-d6 ..................................... 97 Bảng 3.24: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (12) trong dung môi aceton-d6 và hợp chất β-hydroxypropiovanillon trong dung môi cloroform-d1 .... ..98 Bảng 3.25: Bảng kết quả hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 10 hợp chất cô lập từ ruột thân cây núc nác .................................................................................. 98 Bảng 3.26: Kết quả đo mật độ quang theo thời gian khảo sát ................................ 99 Bảng 3.27: Thể tích các dung dịch nền và giá trị mật độ quang đo được tương ứng ...................................................................................................................................... 100 Bảng 3.28: Kết quả mật độ quang theo sự thay đổi nồng độ chất nền và chất ức chế ............................................................................................................................ 101 Bảng 3.39: Bảng xử lý số liệu mẫu control và mẫu ức chế .................................. 102 Bảng 3.30: Giá trị Kht/Vht ứng với các nồng độ ức chế khác nhau ........................ 103 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Phân loại bệnh tiếu đường ..................................................................... . 2 Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] .......................................... . 9 Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền ............................... 11 Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk ..................................................................................................................... 11 Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh .......................................................................... 12 Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế cạnh tranh .............................................................................. 13 Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn Kct theo [I] khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định Ki .............................................................................................................................. 14 Hình 1.8: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh ................................................................ 14 Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế kháng cạnh tranh .................................................................... 15 Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn 1/Vkct và 1/Kkct theo [I] khi có chất ức chế kháng cạnh tranh để xác định Ki .............................................................................................. 16 Hình 1.11: Kiểu ức chế không cạnh tranh ............................................................. 16 Hình 1.12: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk khi có ức chế không cạnh tranh ................................................ 17 Hình 1.13: Đồ thị biểu diễn 1/Vkoct theo [I] khi có chất ức chế không cạnh tranh để xác định Ki ........................................................................................................... 18 Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk khi có ức chế hỗn tạp ................................................................ 19 Hình 1.15: Đồ thị biểu diễn Kht/Vht theo [I] khi có chất ức chế hỗn tạp để xác định Ki .......................................................................................................................... 19 Hình 1.16: Hợp chất disaccarit ức chế enzym α-glucosidase ................................ 22 Hình 1.17: Các hợp chất iminosugar ức chế enzym α-glucosidase ....................... 23 Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym α- glucosidase ........................................................................................................ .. 24 Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym α-glucosidase ............................ 24 Hình 1.20: Các hợp chất không có liên kết glycosidic ức chế enzym α-glucosidase ......................................................................................................................... .... 25 Hình 1.21: Cây núc nác và hoa ............................................................................. 31 Hình 1.22: Quả và hạt cây núc nác ........................................................................ 32 Hình 1.23: Các hợp chất cô lập từ lá cây núc nác .................................................. 34 Hình 1.24: Các hợp chất cô lập từ quả núc nác ..................................................... 35 Hình 1.25: Các hợp chất cô lập từ hạt cây núc nác ................................................ 36 Hình 1.26: Các hợp chất cô lập từ vỏ thân cây núc nác ........................................ 37 Hình 1.27: Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ cây núc nác ............................................. 39 Hình 2.1: Cấu trúc của acarbose ........................................................................... 52 Hình 2.2: Cấu trúc của acid tannic ........................................................................ 52 Hình 2.3: Đường biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk ................................... 54 Hình 3.1: Cấu trúc các hợp chất cô lập được từ thân cây núc nác..................... ..... 71 Hình 3.2: Cấu trúc của hợp chất (1) ...................................................................... 72 Hình 3.3: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (1) .................................... 73 Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất (2) ...................................................................... 74 Hình 3.5: Nhóm đường glucuronid của hợp chất (2) ............................................. 75 Hình 3.6: Tương quan HMBC của hợp chất (2) .................................................... 75 Hình 3.7: Cấu trúc của hợp chất (3) ...................................................................... 77 Hình 3.8: Tương quan HMBC của hợp chất (3) .................................................... 78 Hình 3.9: Cấu trúc của hợp chất (4) ...................................................................... 80 Hình 3.10: Cấu trúc của hợp chất (5) .................................................................... 81 Hình 3.11: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (5) .................................. 83 Hình 3.12: Cấu trúc của hợp chất (6) .................................................................... 84 Hình 3.13: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (6) .................................. 85 Hình 3.14: Cấu trúc của hợp chất (7) ..................................................................... 87 Hình 3.15: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (7) ....................................88 Hình 3.16: Cấu trúc của hợp chất (8) ......................................................................90 Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất (9) .......................................................................91 Hình 3.18: Cấu trúc của hợp chất (10) .............................................................. ......92 Hình 3.19: Cấu trúc của hợp chất (11) .......................................................