Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật RAPD

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên tài nguyên thực vật rất dồi dào, với diện tích rừng của Việt Nam chúng ta thấy được sự đa dạng các loài trong hệ sinh thái thực vật là vô cùng phong phú. Với mục tiêu trồng rừng phát triển kinh tế, tạo nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp cũng như các làng nghề thì sản phNm từ rừng của chúng ta phải ngày càng được nâng cao cả về chất lượng và sản lượng. Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) là một trong những loài lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao. Song mật có đường kính lớn, dài, bền, dẻo, dễ uốn và chịu lực tốt nên đây là nguyên liệu sử dụng trong các làng nghề mây tre đan trên cả nước. Với sự quan tâm đầu tư của nhà nước cho các cơ sở sản xuất tiểu thủ công nghiệp thì số lượng sản phNm từ các làng nghề mây tre đan ngày càng tăng nhưng tỷ lệ nghịch với sự gia tăng này chính là sự giảm sút nghiêm trọng của nguyên liệu đầu vào. Theo thống kê, khoảng 35 – 42% các cơ sở mây tre đan đang phải sản xuất cầm chừng và có nguy cơ đóng cửa vì thiếu và không chủ động được nguyên liệu. Việc thiết lập những vùng nguyên liệu chuyên canh tập trung Song mật là một nhu cầu bức bách đối với nước ta hiện nay. Trên cả nước đã có nhiều tỉnh triển khai việc nhân giống Song mật nhưng công tác nhân giống chỉ mang tính gây trồng và bằng hình thức gieo ươm hạt tạo cây con rồi đưa vào trồng rừng sản xuất nhưng với song mây trong giai đoạn phát triển của chúng luôn phải trải qua giai đoạn cỏ. Đây là giai đoạn mà cây con tạo nhiều chồi, thời gian để các chồi phát triển là rất lâu, điều này kéo theo sự chậm phát triển của cây trồng. Để khắc phục giai đoạn cỏ này hiện nay chỉ có thể bằng các phương pháp nuôi cấy invitro. Giải quyết vấn đề thiếu nguồn nguyên liệu và suy giảm nhanh chóng nguồn tài nguyên thực vật này ngày 12 tháng 5 năm 2008 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định số 1462/QĐ/BNN-KHCN về việc: “Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro” 2 phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và nhân giống Song mật đưa nhanh vào trồng rừng sản xuất. Nhận thức được tầm quan trọng của nguồn nguyên liệu đưa vào nhân giống sản xuất. Để có nguồn nguyên liệu tốt cho công tác nhân giống thì việc đánh giá, kiểm tra chất lượng nguồn giống là vô cùng quan trọng. Một trong những phương pháp đem lại hiệu quả, độ chính xác cao, rút ngắn được thời gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bởi nó cho chúng ta biết về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng 1 loài và giữa các loài khác nhau. Đến nay các nghiên cứu về tính đa hình cũng như tính đa dạng di truyền của Song mật để phục vụ công tác chọn giống ở Việt Nam vẫn còn bỏ ngỏ. Vì vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật RAPD.” Đề tài đặt mục tiêu là đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu từ đó làm cơ sở cho việc xác định xuất xứ, giúp các nhà chọn giống có kết luận chính xác về tính di truyền của các tính trạng mang phNm chất tốt của đối tượng. Phục vụ cho công tác tuyển chọn và nhân giống các dòng Song mật có thời gian nuôi trồng ngắn, phNm chất tốt, sản lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất và chất lượng sản phNm đầu ra. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Vấn đề chung về sinh học phân tử trong phân tích đa dạng di truyền Sự ra đời và phát triển của sinh học hiện đại đã cung cấp những công cụ thích hợp cho phân tích, nghiên cứu di truyền một cách nhanh chóng và hiệu quả. Đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhờ đó mà sự biến đổi di truyền được nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ ADN và có thể phát hiện ra lượng lớn tính đa hình tạo ra do đột biến. Vì vậy, làm cho kết quả của việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phong phú, chính xác hơn so với chỉ thị hình thái. Một số kỹ thuật ADN hiện đang được sử dụng phổ biến là đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) và các kỹ thuật dựa vào chuỗi phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) như: đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism ADN – RAPD); Microsatellite hay còn gọi là đa hình các đoạn lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR); Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP); . . . Tuy nhiên, không có kỹ thuật sinh học phân tử lý tưởng nào đáp ứng được tất cả các chỉ tiêu, mỗi loại đều có những thế mạnh và hạn chế riêng. 1.1.1. Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) Kỹ thuật RFLP (Bot Stein, et al., 1980), dùng các cADN hoặc ADN ngẫu nhiên trong hệ gen như các mẫu dò, các mẫu dò này được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc enzyme tiếp hợp để phát hiện các đoạn ADN có độ dài khác nhau được tạo ra khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt ADN hệ gen và phân tách bằng phương pháp điện di trên gel [26]. Nếu trình tự nhận biết có mặt ở một vị trí trên hệ gen của một cá thể nhưng không có mặt ở cá thể khác, enzyme sẽ tạo ra các đoạn hạn chế có kích thước khác nhau ở vị trí này. Kết quả làm phát sinh hàng ngàn đoạn ADN có kích thước khác nhau. 4 RFLP là chỉ thị đồng hợp trội, các đoạn ADN từ tất cả các nhiễm sắc thể (NST) đồng dạng đều được phát hiện. Vì vậy, RFLP là chỉ thị rất đáng tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống. RFLP có thể xác định một đặc điểm liên kết ở trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của một cá thể, đây là điều đặc biệt lý tưởng đối với các tính trạng lặn. RFLP được ứng dụng có hiệu quả trong nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn giống, lập bản đồ phân tử. Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng ứng dụng của chỉ thị RFLP lại tốn kém về kinh tế và thời gian. Phương pháp này cần sử dụng lượng lớn ADN nên đòi hỏi sự thành thạo về kỹ thuật và các điều kiện phòng thí ngiệm đặc biệt. 1.1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR). Phản ứng PCR được Mullis và cộng sự đưa ra năm 1986. Đây là phản ứng tổng hợp ADN invitro nhờ ADN polymerase của vi khuNn với một mồi đặc trưng như một điểm xuất phát cho sự nhân lên của ADN khuôn. Quá trình tổng hợp diễn ra trên một máy điều chỉnh nhiệt, quy trình chạy PCR gồm 25 – 40 chu kỳ. Sản phNm ADN đặc trưng được nhân lên theo cấp số nhân với công thức tính: N = (2n – 2n). x Trong đó: n: số chu kỳ chạy phản ứng 2n: số phân tử có chiều dài không xác định x: số phân tử khuôn ban đầu N: số sợi tổng hợp được trong phản ứng. 2n: số phân tử có chiều dài bằng khoảng cách giữa 2 mồi [3]. Kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở là các đoạn nucleotide với kỹ thuật PCR để phát hiện các locus đơn gen hoặc đa gen trong hệ gen sinh vật, có thể đòi hỏi hoặc không đòi hỏi không trình tự, có thể khác nhau về mức độ 5 tin cậy, mức độ khó khăn và sự chi phí, cũng như bản chất của sự đa hình mà chúng phát hiện. Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật liệu di truyền của cơ thể sống ở mức ADN. Biến đổi di truyền được nghiên cứu trực tiếp ở mức độ ADN có thể phát hiện ra một lượng lớn sự đa hình tạo ra do đột biến, vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị hình thái. Để phân biệt các xuất xứ khác nhau, có thể dùng nhiều phương pháp. Một trong những phương pháp đem lại hiệu quả cao, chính xác, rút ngắn được thời gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bởi nó cho phép chúng ta hiểu biết về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau làm cơ sở cho việc xác định xuất xứ [1, 4]. Sự ra đời của PCR đã làm thay đổi lớn trong sinh học phân tử, đánh dấu sự ra đời của hàng loạt chỉ thị phân tử: RAPD, AFLP, SSR. 1.1.2.1. Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP). AFLP được phát triển bởi Zabeau và Vos (1993) [30] và được mô tả chi tiết bởi Vos và cộng sự (1995) [28]. AFLP là kỹ thuật di truyền mới dựa trên cơ sở PCR, AFLP đã phối hợp được sự tin cậy của RFLP và sự thuận lợi của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm ba bước: (1) : Cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter). (2) : Nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn. (3) : Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên. Đây là kỹ thuật có nhiều ưu điểm trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở nhiều đối tượng khác nhau: đậu tương [24], lập bản đồ hệ gen và định vị các gen, phát triển chỉ thị chuNn ở khoai tây [8], ở lúa mỳ, xác định các gen kháng virus ở đậu tương [28], ở khoai tây [11], ở lạc [13]. 6 AFLP là một kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống có sự trợ giúp của chỉ thị [10, 21]. Tuy nhiên, phân tích AFLP trước đây có giá thành cao, đòi hỏi có kỹ thuật phòng thí nghiệm thành thạo vì AFLP thường dùng đồng vị phóng xạ để phát hiện các đoạn ADN được nhân lên trong phản ứng PCR, song điều này đã được khắc phục khi sử dụng các kỹ thuật nhuộm huỳnh quang và nhuộm bạc thay cho việc sử dụng đồng vị phóng xạ. Sự thay thế này giúp cho giá thành khi sử dụng kỹ thuật giảm đi rất nhiều, không đòi hỏi những thiết bị quá đắt, các thao tác kỹ thuật đơn giản hơn mà vẫn đảm bảo độ nhạy và tính chính xác của kết quả. Với việc thay thế bằng nhuộm huỳnh quang và nhuộm bạc AFLP đã trở thành một kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay trong nghiên cứu di truyền và lập bản đồ liên kết phân tử. 1.1.2.2. Trình tự vị trí đánh dấu (STS - Sequence Tagged Sites) STS được tạo ra đầu tiên bởi Olson và cộng sự (1989) dựa vào một loại locus đã biết (gen, cADN, hoặc gen tách dòng) được nhân lên bởi mồi PCR thiết kế dựa vào trình tự đầu cuối của những locus đặc trưng này. Dựa trên cơ sở PCR nó phát hiện một điểm có trình tự xác định, nó không đòi hỏi sự phân lập nhưng đòi hỏi trình tự. Mồi có 18 – 20bp được thiết kế để nhân đoạn ADN ngắn, duy nhất trên ADN đã biết trình tự (có thể là trình tự của sản phNm PCR với chỉ thị RAPD hoặc RFLP) sự đa hình nói chung được xác định như sự khác nhau về kích thước của sản phNm PCR trên gel agarose. EST (Expressed Sequence Tag) là một chỉ thị dựa trên cơ sở PCR với mồi dài 18 – 20 nucleotide được thiết kế từ những phần trình tự đã biết trên hệ gen như các đoạn cADN, nó không đòi hỏi sự phân lập nhưng đòi hỏi trình tự và phát hiện vùng biểu hiện duy nhất của hệ gen nên thích hợp đối với lập bản đồ. Sự đa hình nói chung được phát hiện bởi sự khác nhau về kích thước của 7 sản phNm PCR. Tuy nhiên việc thiết kế và chuNn hoá mồi có thể đòi hỏi sự đầu tư đáng kể. Một chỉ thị khác của STS dựa trên kỹ thuật RAPD là SCARs (Sequence Characterised Amplified Regions). Các chỉ thị này dựa trên việc tách dòng và đọc trình tự các đoạn RAPD được quan tâm (có thể vì chúng liên kết với gen được quan tâm), từ trình tự đã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thường dùng trong RAPD (24 nucleotide) bổ sung chính xác với trình tự đầu cuối của đoạn RAPD ban đầu. Khi các mồi này được dùng trong PCR, một locus đơn được xác định tương ứng với đoạn ADN ban đầu của locus này. SCARs tiến bộ hơn RAPD là các kết quả có khả năng lặp lại (dùng mồi dài hơn) và là các chỉ thị đồng trội. Chỉ thị CAPS hay "Cleaved Amplified Polymorphic Sequences" [15] cũng là một ví dụ của STS, được tạo ra bằng cách cắt các sản phNm PCR với một enzym hạn chế. Chỉ thị ADN này vẫn mang những ưu điểm cơ bản của PCR là chỉ cần một lượng nhỏ nanogram (ng) ADN và phát hiện dễ dàng nhờ kết quả huỳnh quang. Các mồi PCR dài hơn (15 – 25 nucleotide) dùng cho CAPS có xu hướng tạo ra những sản phNm ổn định hơn RAPD hoặc các kỹ thuật mồi ngẫu nhiên khác. Tuy nhiên, CAPS cũng có mặt hạn chế là các cá thể có liên hệ gần gũi thường chứa các alen giống nhau. Điều này gây trở ngại nghiêm trọng trong việc tạo cặp lai giữa các dạng khác nhau. 1.1.2.3. Chỉ thị đoạn lặp đơn giản (Simple sequence reapeats – SSR) SSR còn gọi là Microsatillite được Litt và Luty (1989) [20] phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử. Microsatellite là đơn vị lặp lại rất ngắn 1 – 5bp, chúng xuất hiện và phân bố ở gần tâm động hoặc đầu mút của các NST, có vai trò giữ tính ổn định của bộ NST ở các quá trình phân bào trong hệ gen của tất cả sinh vật nhân thực [5, 26]. Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn 8 đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide. Đa hình về độ dài các đoạn microsatellite cũng có thể được phát hiện khi lai với ADN trên gel hoặc có thể được nhân bằng PCR để tách dòng, đọc trình tự với mồi là các đoạn oligonucleotide phụ cận. Các vị trí microsatellite là các chỉ thị đồng trội vì vậy chứa đựng thông tin cao. Microsatellite cũng là một chỉ thị trong lập bản đồ và xác định chỉ thị chuNn. Ở động vật microsatelllite với trình tự CA/GT lặp lại là phổ biến nhất, trình tự này ít thấy ở nhiều thực vật vì ở thực vật trình tự lặp lại AT/TA phổ biến hơn nhiều, tiếp đó là trình tự GA/CT. Trong hệ gen lúa (GA)n lặp lại cứ 225kb một lần và (GT)n lặp lại cứ 480kb một lần. Sự phân tích trình tự lặp lại là hết sức quan trọng đối với phân tích hệ gen thực vật vì trình tự lặp lại đặc trưng cho ADN hệ gen của cá thể. Perry Creengam đã sử dụng kỹ thuật SSR để phát hiện ra sự khác nhau giữa các thứ đỗ mà không phân biệt được bằng kỹ thuật RADP. Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị khác. Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ, sử dụng một lượng ADN và ít tốn thời gian vì vậy kỹ thuật SSR có nhiều ứng dụng trong việc lập bản đồ phân tử. Kochert đã sử dụng chỉ thị SSR để lập bản đồ liên kết di truyền ở lúa [29]. Đánh dấu các gen quan trọng, sử dụng trong nghiên cứu ở một vài thực vật bao gồm: Lúa [29] và đậu tương [7], kỹ thuật in dấu ADN và được dùng cho xác định các dòng lai từ các loài hoang dại trong cải biến giống cây trồng. Hạn chế của các chỉ thị SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một lượng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR [16]. Tuy nhiên dựa vào các ngân hàng gen đã có hiện nay có thể thiết kế các tổ hợp mồi cho SSR ở nhiều loài cây khắc phục được phần nào hạn chế này. 9 1.1.2.4. Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism ADN – RAPD) 1.1.2.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD Đây là một kỹ thuật phân tử dựa trên cơ sở của phản ứng PCR do Welsh và Mc ClellADN, 1990; Williams và cộng sự, 1990 đề xuất. Kỹ thuật RAPD sử dụng các mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên dài từ 9 – 12 nucleotide các mồi này thường có hơn 60%(G +C) để đạt được liên kết với mẫu đủ mạnh. Các mồi ngẫu nhiên là ngắn nên khả năng nó tìm được những điểm gắn theo nguyên tắc bổ sung trên ADN là không quá khó khăn. Điện di kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những băng, vạch ADN ở những vị trí giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu kiểm tra có sự khác nhau (có đa dạng sinh học) cho kết quả khác nhau trên điện di đồ. Kết quả của phản ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN khác nhau về độ dài và trình tự. Một mồi ngẫu nhiên có thể cho kết quả là có băng nhân bản với ADN từ nguồn này nhưng lại không xuất hiện băng nhân bản với ADN từ nguồn khác [5, 12]. Sản phNm PCR gồm nhiều đoạn ADN có kích thước từ 200bp đến hơn 3kb. Sự khác nhau của các đoạn ADN được phát hiện khi điện di sản phNm PCR trên gel agarose. Sự khác nhau của các đoạn nói chung là do đột biến ở vị trí gắn mồi ngăn trở việc bắt cặp của mồi. Các đoạn này được ghi nhận như các yếu tố di truyền Mendel trội trong một cơ thể lưỡng bội. 1.1.2.4.2. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật RAPD RAPD là một phương pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng một lúc. Đây là một kỹ thuật có giá thành thấp, đơn giản, sử dụng lượng nhỏ ADN khuôn, không dùng kỹ thuật lai và mẫu dò phóng xạ nên không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Vì vậy, trong những năm gần đây phân tích RAPD trở thành phương pháp phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền và phân loại thực vật, xác định các đặc điểm quan trọng và nguồn gốc. 10 Mỗi mồi cung cấp số liệu từ nhiều vị trí trong hệ gen vì vậy những đa hình hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh hơn với phân tích locus đơn. Tuy vậy, RAPD là chỉ thị trội nên không phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp nên RAPD không được sử dụng rộng rãi trong xây dựng bản đồ và do mồi ngắn (10 nucleotide) nên khi chạy phản ứng PCR sẽ chịu nhiều ảnh hưởng của các yếu tố [6]. Mồi ngắn dễ dàng bị ảnh hưởng của điều kiện gắn mồi nên kết quả có hệ số an toàn không cao, sự nhạy cảm cao với điều kiện phản ứng như: chất lượng, nồng độ ADN khuôn; nồng độ dung dịch đệm (đặc biệt là Mg2+); nồng độ ADN polymerase; nồng độ nucleotide (dNTP: A, U, G, C) là những hạn chế chính của kỹ thuật. Do thiếu sự ổn định, kỹ thuật RAPD bị hạn chế sử dụng trong lập bản đồ QTL các quần thể lai và ít được dùng trong những trường hợp lập bản đồ so sánh. Bên cạnh đó là sự phát sinh đa hình giả ảnh hưởng đến sự thể hiện của các đoạn RAPD do không chắc chắn các đoạn cùng kích thước từ hai mẫu ADN khác nhau có thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen hay không. Tuy nhiên, kỹ thuật với mồi ngẫu nhiên có nhiều ứng dụng trong các thí nghiệm đòi hỏi một số lượng lớn bản sao để kiểm tra độ tin cậy nên kỹ thuật RAPD vẫn là lựa chọn thích hợp cho công tác đánh giá đa dạng di truyền. 1.1.2.4.3. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD RAPD thường được dùng trong nghiên cứu phát sinh loài và dùng trong phân tích sự phân ly các dòng gần đồng gen (near isogenic lines - NIL) [22], RAPD được dùng nhiều nhất trong xác định các trạng thái khác nhau, xác định quan hệ di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền ở nhiều loài cây như lúa, đậu tương, lúa mạch đen, kiều mạch, đậu Hà Lan, hoa hồng... [23, 18, 24, 25]. Cùng với RFLP hoặc SSR, RAPD được dùng để xây dựng bản đồ liên 11 kết di truyền (bản đồ có mật độ cao trong nhiều trường hợp) ở nhiều loài cây: rau diếp, củ cải đường, lúa mạch... [17, 27, 29]. Trong một số ít trường hợp RAPD được dùng trong xác định QTL của nhiều đặc điểm nông học như: các đặc điểm về năng suất ở lúa mạch và lúa, trong xác định gen điều khiển các đặc điểm đơn gen ở cà, rau diếp [14, 17]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra RAPD là một phương pháp hữu hiệu để xác định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứu phát sinh loài (hệ thống phát sinh) và lập bản đồ di truyền. 1.2. Tình hình nghiên cứu về Song mật Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) thuộc họ cau (Arecaceae), nằm trong nhóm gỗ trung bình. Với giá trị sử dụng cao và được người dân sử dụng từ rất lâu nên đã có nhiều nghiên cứu về Song mật. 1.2.1. Phân bố, đặc điểm hình thái Song mật Song mật là loài cây ưa sáng và Nm, luôn vươn lên tầng cao nhất của tán rừng. Mọc trên đất feralit vàng, trên núi đá và các loại đất phong hóa trên phiến thạch, sa thạch, granit hoặc đá vôi. Cây thường mọc ven thung lũng núi, chân và sườn núi đá, ven và dọc các khe Nm. Nơi có độ dốc 30 – 50o cũng thấy Song mật. Song mật mọc xen lẫn rừng Tre, Vầu ở độ cao 100 – 1,500m, tập trung nhiều ở độ cao 400 – 900m. Trên thế giới, Song mật chủ yếu tập trung nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác. Ở Trung Quốc Song mật chủ yếu phân bố ở tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900m thành từng cụm lớn. Ở Việt Nam đây là loài cây cận đặc hữu thường gặp ở ở các tỉnh từ