Nghiên cứu và thu nhận enzym protease từ các chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Trần Thị Nhã Uyên NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG NẤM SỢI Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT. Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN THANH THỦY TP. Hồ Chí Minh , tháng 7 – năm 2010 MỞ ĐẦU Lí do chọn đề tài. Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của sinh vật mà còn có vai trò rất lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kĩ thuật phân tích, công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Do có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực mà ngành công nghiệp enzyme đã đem lại lợi nhuận to lớn cho nhiều nước. Ở Việt Nam, ngành công nghệ enzyme vẫn chưa thật sự phát triển. Mỗi năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn các enzyme để ứng dụng vào sản xuất công, nông nghiệp, giải quyết ô nhiễm MT Trong các loại enzyme, protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất. Năm 1995, tổng doanh thu từ enzyme này ở các nước châu Âu lên đến 187,2 triệu USD, cao nhất trong các loại enzyme. Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, nông nghiệpNguồn protease chủ yếu hiện nay thu được từ VSV, đặc biệt là các chủng NS thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Mucor. Việc nghiên cứu và phân lập các chủng NS trong tự nhiên để thu nguồn protease mới có giá trị là vấn đề đang được khoa học quan tâm nghiên cứu. Để thu được nguồn protease mới có giá trị cần phải phân lập các chủng mới có trong tự nhiên. Một trong những hướng nghiên cứu mà khoa học đang quan tâm là tìm các chủng VSV mới có đặc tính ưu việt từ RNM. Chính điều kiện sống khắc nghiệt ở RNM tạo ra nhiều cơ hội tìm thấy các nguồn gen VSV quí hiếm, trong đó có NS sinh protease. Ở nước ta, RNM Cần Giờ là nơi HST phong phú, đa dạng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về đa dạng sinh thái của RNM Cần Giờ chủ yếu tiến hành ở hệ động thực vật. VSV, trong đó NS là một đối tượng được phân bố rộng rãi và có giá trị kinh tế chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây. NS ở RNM Cần Giờ có nhiều đặc tính quí báu như khả năng chịu đựng được điều kiện sống khắc nghiệt, khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào, trong đó có protease. Do RNM Cần Giờ có thảm TV dày đặc, xác động thực vật bị phân hủy tạo thành nguồn cơ chất cho các chủng NS sinh các enzyme ngoại bào. Cho đến hiện nay, các công trình nghiên cứu về NS ở RNM Cần Giờ vẫn còn thưa thớt, trong đó vẫn chưa có công trình nghiên cứu về khả năng sinh protease của các chủng NS. Chính vì những lí do trên mà tôi chọn đề tài “Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng NS ở RNM Cần Giờ”. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: các chủng NS phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lí Nhơn, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ. Địa điểm nghiên cứu: PTN Vi sinh-Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài: Tìm ra một số chủng NS có khả năng sinh protease mạnh từ RNM Cần Giờ và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease. Nhiệm vụ của đề tài:  Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ.  Tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao.  Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng NS tuyển chọn.  Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của các chủng NS được tuyển chọn, từ đó tìm ra MT tối ưu để nuôi cấy NS thu protease.  Thu nhận các chế phẩm enzyme bán tinh khiết. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. RNM Cần Giờ. 1.1.1. Đặc điểm của RNM Cần Giờ. 1.1.1.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên. Về vị trí địa lý: RNM Cần Giờ có tọa độ 10°22’ – 10°40’ vĩ độ Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đông. Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [43]. Hình 1.1. RNM Cần Giờ [43] Nằm cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 70km, RNM Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai ở phía Bắc, giáp biển Đông ở phía Nam, giáp tỉnh Tiền Giang và Long An ở phía Tây, giáp tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu ở phía Đông [43]. RNM Cần Giờ phát triển trên một nền đất đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao với một lượng muối cao không có lợi cho nông nghiệp[17]. Địa hình: huyện Cần Giờ có địa hình thấp trũng, không bằng phẳng, phân cắt bởi mạng lưới sông ngòi uốn khúc. Nhìn chung, địa hình huyện Cần Giờ có 6 dạng: dạng cao 2- 10 m, dạng chỉ ngập vào những tháng có nước lớn (tháng 11, 12) trong năm và 4 dạng còn lại đều ngập triều ở các mức độ khác nhau [9]. Cần Giờ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới xích đạo, hướng gió chính là Tây Nam, mùa mưa bắt đầu muộn và kết thúc sớm hơn so với các địa phương khác trong vùng (từ tháng 5 đến tháng 10), mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau [30]. Nhiệt độ trung bình khoảng 250C - 290C, nhiệt độ thấp nhất là 18,8oC, cao nhất là 35oC. Biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5-7oC [30]. Độ ẩm trung bình từ 73% đến 85%. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 – 1.402 mm [66]. Độ mặn dao động từ 1,8%-3% [2]. Độ mặn cũng thay đổi tùy theo mùa. Vào mùa khô có độ mặn cao hơn vào mùa mưa. Độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố khu hệ SV ở RNM nói chung và NS nói riêng. Chế độ thủy triều: Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông. Mỗi tháng có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Biên độ triều tương đối lớn từ 3- 4m. Thời gian có biên độ triều lớn từ tháng 6- 8. Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [9]. Đất đai: toàn bộ huyện Cần Giờ thuộc loại đất phèn mặn gồm hai loại: đất phèn mặn theo mùa và đất phèn mặn thường xuyên. Đất phèn mặn theo mùa nằm ở phía Bắc huyện Cần Giờ. Đất thịt, giàu mùn, chứa nhiều xác hữu cơ dưới môi truờng yếm khí, chất dinh dưỡng khá, phản ứng của đất từ chua đến rất chua, pH ở độ sâu của tầng sinh phèn xuống tới 2,4-2,7. Tuy nhiên vào mùa lũ, mặn được đẩy ra xa, nước được pha loãng trong thời gian dài 4-5 tháng. Đất phèn mặn thường xuyên chiếm phần lớn diện tích Cần Giờ. Đất thịt trung bình, nhiều mùn nhão lẫn xác hữu cơ bán phân giải, bị ngập triều thường ngày, giàu dinh dưỡng, độ pH từ 5,8-6,5 [66]. 1.1.1.2. Khu hệ SV ở RNM Cần Giờ. RNM Cần Giờ là HST trung gian giữa HST thủy vực với HST trên cạn, HST nước ngọt và HST nước mặn. Rừng Cần Giờ nhận một lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, cùng với ảnh hưởng của biển kế cận và các đợt thủy triều nhờ đó hệ TV nơi đây rất phong phú với trên 150 loài và trở thành nguồn cung cấp thức ăn, nơi trú ngụ cho rất nhiều loài thủy sinh, cá cùng với các ĐV có xương sống khác. Hệ ĐV cũng rất đa dạng gồm khu hệ chim có khoảng 120 loài, ĐV thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên 130 loài, khu hệ ĐV có xương sống có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú [44]. Chính hệ động thực vật đa dạng ở RNM Cần Giờ trở thành nguồn thức ăn phong phú cho các VSV bao gồm nấm men, NS, VK và xạ khuẩn. Nhờ vào khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào như amylase, protease, kitinase, cellulase,chúng phân hủy tinh bột protein, kitin,. có trong xác động thực vật và giáp xác làm nguồn thức ăn. Và bản thân xác động thực vật bị phân hủy trở thành nguồn mùn là lượng thức ăn dồi dào cho hệ TV và các SV phù du. Trung tâm MERD đã nghiên cứu khu hệ VSV ở RNM thuộc các tỉnh Nam Định và Thái Bình (2001). Kết quả phân lập được 69 chủng nấm men, 55 chủng xạ khuẩn. Nhiều chủng có hoạt tính enzyme ngoại bào cao, có khả năng sinh KS và phân giải dầu mạnh [13]. Riêng ở RNM Cần Giờ chưa có nhiều công trình nghiên cứu về nấm men và xạ khuẩn. Qua phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ, các nhà khoa học đã phát hiện có vi khuẩn Bacillus thuringiensis sinh nhiều tinh thể hình cầu có tác dụng tiêu diệt ấu trùng muỗi rất cao. Kết quả thí nghiệm của nhóm nghiên cứu Mai Thị Hằng và Trần Thị Mỹ Hạnh cho thấy các chủng VSV này có khả năng diệt các loại ấu trùng muỗi từ 60-100% sau 36 giờ, có chủng diệt được 100% ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi [61]. NS ở RNM chiếm số lượng lớn, rất phong phú và đa dạng. Khi lá còn ở trên cây đã có một số loài nấm sống trên đó, một số chui sâu vào biểu bì, một số sống trên mặt lá. Khi lá rụng xuống, sau 24 giờ ngập nước triều đầu tiên, lá đã bị các VSV phân hủy, lúc đầu là chi Phytophora thuộc lớp Nấm tảo, rồi đến Fusarium và Penicillium thuộc lớp Nấm bất toàn. Sau tuần thứ 2 và thứ 3, các nấm tảo nhường chỗ cho các loài VSV khác. Tất cả các mô xốp được phân huỷ nhanh nhất, còn các hợp chất cellulose và lignin bị phân hủy cuối cùng. Trong quá trình phân hủy, lượng đạm trên các mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971). Khi phân tích, so sánh các loại acid amin có trong lá tươi và lá phân huỷ, Casagrade (1970) đã thấy sự tăng tổng số các acid amin trên bề mặt lá và trong thành phần lá phân hủy cao hơn hẳn lá tươi. Một số acid amin như α – aminobyturic, α, γ diaminnobutyric và α, ε diamino pimonic cùng các loại acid citruline, ortrithine, cystein là các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của VSV [51]. Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được một điều: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứu về RNM ở Nam Định và Thái Bình của trung tâm MERD cũng phân lập được 605 chủng NS [13]. Ở RNM Cần Giờ, tác giả Khưu Phương Yến Anh đã phân lập được 312 chủng NS, trong đó bao gồm các loài nấm thuộc các chi Penicillum, Aspergilus, Mucor, Tricoderma (2007) [1]. Tác giả Võ Thị Bích Viên đã phân lập được 476 chủng NS trong đó có 266 chủng thuộc chi Aspergillus và Penicillium (2009) [32]. 1.1.2. Vai trò của RNM Cần Giờ. RNM Cần Giờ được mệnh danh là "lá phổi xanh" của TP.HCM với vai trò quan trọng trong điều hòa khí hậu. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... RNM được đánh giá là một “bức tường xanh” vững chắc chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm sạch MT ven biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm, tích lũy cacbon, giảm khí CO2,... [51]. RNM có vai trò trong vấn đề giảm ô nhiễm từ chất thải rắn. Trong những năm qua, Trung tâm nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện nhiều VSV có khả năng phân giải các chất thải khó phân hủy có trong nước, làm sạch nước và biến thành thức ăn cho tôm cá. Nhờ đó phát hiện thêm khả năng ngăn ngừa ô nhiễm môi trường của RNM. Khi có rừng, dưới tán rừng nhiệt độ thấp, lá cây rụng tạo thành mùn, vi sinh vật hoạt động rất tốt, quá trình phân giải chất hữu cơ diễn ra hiệu quả. Nhưng khi rừng mất đi thì ánh nắng chiếu thẳng vào, nhiệt độ sẽ tăng cao và thiếu nước vào mùa khô, làm cho đất phèn tiềm tàng trước được ém sẽ hoạt động trở lại, làm cho đất chua, nhiều acid [53]. Bên cạnh đó, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ SV ở đây và làm trong sạch nước biển [51]. RNM Cần Giờ có vai trò nhất định đối với nền kinh tế. Theo Giáo sư Phan Nguyên Hồng, hiện nay người dân Việt Nam mới chỉ biết tận dụng một phần rất nhỏ lợi ích từ RNM mang lại. Nếu biết cách khai thác hợp lý đi đôi với bảo vệ rừng, đây quả thực là một nguồn tài nguyên không phải quốc gia nào cũng có được [54]. 1.2. Đặc điểm của NS sinh protease. 1.2.1. Đặc điểm hình thái. NS là VSV nhân thực, tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng, vách tế bào cấu tạo chủ yếu là kitin, có hay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp [55]. Sợi nấm có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3- 5µm, có khi đến 10µm thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông. Trên MT đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là KL nấm [55]. Hình 1.2. Sợi nấm có vách ngăn [55] Hình 1.3. Sợi nấm không có vách ngăn [55] Hệ sợi của NS một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Những khuẩn ty khí sinh là những lông tơ màu trắng, mọc thành lớp sợi mềm và dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử. Màu sắc bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc NS khi già [23]. 1.2.2. Cấu tạo của tế bào NS  Thành tế bào NS Thành tế bào NS có cấu tạo bản mỏng và cấu tạo sợi [7]. Thành tế bào NS dày khoảng 2 μm, nhưng rất chắc chắn [7]. Thành sợi nấm gồm nhiều bản mỏng chồng chất lên nhau nhờ đó mà vững và chịu được sức ép các chất lỏng và rắn ở bên trong mà không bị rách hay nứt vỡ [7]. Mỗi bản mỏng gồm có phần nền không có cấu tạo đặc biệt, trên phần nền có các sợi nhỏ xếp sát vào nhau và song song nhau. Điều đặc biệt là các sợi ở một bản mỏng song song với nhau nhưng các sợi trên hai bản mỏng liên tiếp lại xếp chéo nhau, do đó làm cho vách sợi nấm rất mỏng nhưng rất vững chắc [7]. Về thành phần hóa học, các hợp chất hóa học có chủ yếu ở vách sợi nấm cũng là những phân tử có dạng sợi. Thảnh phần quan trọng ở vách sợi nấm là kitin. Một hợp chất gluxit khác cũng phổ biến ở nhiều NS là glucan. Có thể coi kitin và glucan là khung của vách sợi nấm [7]. Vách sợi nấm không những che chở và bảo vệ, mà còn đảm đương một loạt các chức năng khác: nhận thức ăn, chế biến thức ăn, thải chất bã, trao đổi khí,. Để hoàn thành nhiệm vụ đó, ngoài kitin, glucan, còn có hàng rào lipit, protit và một loạt các enzyme. Ngay trong vách sợi nấm còn có các sản phẩm trao đổi chất khác nhau của sợi nấm, các chất thải như acid oxalit, acid xitric, các chất độc hại đối với các VSV khác ở xung quanh như các KS, các độc tố. Mặt ngoài của vách sợi vi nấm còn có phủ chất dính, chất dính này sẵn sàng dính chặt vào những con amip, những con giun tròn bé tẹo, sau đó các vi nấm này ăn thịt con mồi bằng cách mọc ra các sợi nấm đặc biệt xuyên qua vỏ con mồi và hút dần các chất dinh dưỡng trong con mồi [7].  Màng nguyên sinh, chất nguyên sinh. Chất nguyên sinh là một dung dịch keo, thường trong suốt không màu, luôn chuyển động từ phần sợi nấm già đến phần non, hoặc từ sợi nấm sinh dưỡng đến các sợi nấm phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản [6]. Chất nguyên sinh được bao bọc bởi màng nguyên sinh. Màng dày trung bình 7.10-3 μm, cấu tạo chủ yếu bởi các phân tử lipit và protein. Thành phần lipit có thể chiếm tới 40% và protein chiếm 38% trọng lượng khô của màng [6].  Các bào quan. Mạng lưới nội chất. Có dạng bọng đài nối liền với màng nhân của tế bào. Người ta cũng tìm thấy mạng nội sinh chất có dạng bản mỏng đồng tâm dính vào màng chất nguyên sinh hay tự do trong chất nguyên sinh hoặc dính vào bộ máy Golgi [7]. Bộ máy Golgi Bộ máy Golgi có dạng một cái túi nhỏ gấp nếp với các bọng nhỏ hình cầu ở xung quang thành túi. Kiểu cấu tạo bộ máy Golgi này giống như ở các TV bậc cao[7]. Ty thể Ty thể của tế bào vi nấm tương tự như ty thể của TV và ĐV. Tuy nhiên, số lượng ty thể ở nấm ít hơn, ty thể dẹt hơn và gồ ghề hơn ở TV [7]. Không bào và các thể ẩn nhập. Không bào thường có hình cầu, hình trứng. Ở ngọn các sợi nấm hầu như không có không bào, càng xa phần ngọn, số lượng không bào càng giảm nhưng kích thước càng lớn, ép chặt chất nguyên sinh và nhân tế bào vào sát thành tế bào. Dịch không bào thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Dịch không bào chứa các chất điện giải hòa tan: Na, Kmột số chất hữu cơ ở trạng thái hòa tan hoặc trạng thái keo (protein, glucid,.), các sắc tố và một số vật thể ẩn nhập [7]. Nhân tế bào NS Nhân tế bào NS nói chung có kích thước rất nhỏ, phần lớn có đường kính 2-3 μm, hình cầu hoặc hình trứng [6]. Số lượng nhân trong tế bào không ổn định. Ở các sợi nấm ngăn vách số lượng nhân ở mỗi đoạn sợi nấm giữa 2 vách ngăn có thể là 1,2 hoặc nhiều hơn. Số lượng nhân ở mỗi tế bào còn thay đổi tùy điều kiện sống [7]. Nhân của tế bào NS là nhân thực. Nhân có vai trò chủ yếu là mang thông tin di truyền chứa trong ADN, điều khiển tổng hợp các protein đặc trưng ở mỗi loài, điều khiển tổng hợp enzyme, các hoạt động của enzyme và nhiều hoạt động khác của tế bào [7]. 1.2.3. Các hình thức sinh sản. NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính.  Sinh sản vô tính Hình thức sinh sản vô tính đơn giản nhất là bằng mẩu sợi: một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới [23]. Ngoài sinh sản vô tính bằng mẩu sợi, NS còn sinh sản bằng bào tử (bào tử kín, bào tử trần). Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến ở NS [23]. Có hai dạng bào tử vô tính là bào tử kín và bào tử trần [23].  Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: • Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp 2 tế bào trần của 2 giao tử. • Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội. • Giảm phân: giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội) [55]. 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến ST và hoạt độ protease của NS. 1.2.4.1. Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến nồng độ các chất hòa tan trong MT nuôi cấy, MT lên men và hoạt động xúc tác các phản ứng sinh hóa trong mỗi tế bào VSV, các phản ứng này chỉ xảy ra ở nhiệt độ nhất định [18]. Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển của NS là từ 2oC đến 5oC, tối ưu từ 22oC đến 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt có một số loài có thể sống sót ở 0oC và ở 60oC [55]. Để thu protease từ NS, nhiệt độ nuôi cấy được giữ ở 29-31oC trong khoảng thời gian 10-18 giờ, sau đó giảm nhiệt độ xuống 24 -25oC [21]. Với nhiệt độ trung bình là 25,8 oC, RNM Cần Giờ có điều kiện nhiệt độ thuận lợi cho sự phát triển của NS. 1.2.4.2. Độ ẩm. Hình 1.4. Bào tử kín [57] Hình 1.5. Bào tử trần Hình 1.6. Quá trình tiếp hợp [57] Mỗi loài NS thích ứng với một khoảng độ ẩm tương đối [6]. Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy NS là 50-60%, nếu độ ẩm < 60%, hoạt tính enzyme sẽ giảm [6]. Độ ẩm môi trường cần duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao làm giảm độ thoáng khí của MT, độ ẩm thấp kìm hãm sự phát triển và sự tạo enzyme của VSV [19], [23]. Trong sản xuất protease, độ ẩm của MT nuôi cấy được duy trì khoảng 50-55% [21]. 1.2.4.3. pH pH ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng hoạt hóa của VSV, mỗi loài VSV chỉ thích hợp ở một khoảng pH nhất định [20]. Nói chung, NS có thể phát triển tốt ở MT acid (pH=6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH 9 (Ingold, 1967) [57]. pH của MT có ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp. Nếu giữ pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, VSV sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng protease xác định chiếm ưu thế trong MT. pH của nước biển ở RNM Cần Giờ vào thời điểm thu mẫu là 7,02. pH đất trung bình 5,8-6,5. Ở tầng mặt, do ảnh hưởng của nước biển, pH có thể cao hơn giá trị trung bình. Nhìn chung pH ở đây thu