Nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

10 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 Nh©n nhanh gièng hoa ®ång tiÒn b»ng kü thuËt nu«i cÊy m« Mai V¨n Chung(a), Phïng V¨n Hµo (b) Tãm t¾t. Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh nh©n gièng v« tÝnh c©y ®ång tiÒn b»ng kü thuËt nu«i cÊy m« in vitro, b−íc ®Çu, chóng t«i thu ®−îc kÕt qu¶: Chåi ®Ønh ngän tr−íc khi ®−a vµo nu«i cÊy in vitro ®−îc khö trïng kÐp b»ng cån 700 trong 1 phót vµ HgCl2 0,1% trong 10 phót; M«i tr−êng nh©n nhanh chåi ®ång tiÒn: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% n−íc dõa; M«i tr−êng ra rÔ cho chåi ®ång tiÒn: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l α-NAA. I. §Æt vÊn ®Ò C©y ®ång tiÒn (Gerbera jamesonii B.) lµ mét loµi thuéc hä Cóc (Asteraceae) cho hoa quanh n¨m. Hoa ®ång tiÒn ®−îc coi lµ mét trong 10 lo¹i hoa ®Ñp nhÊt trªn thÕ giíi (chØ xÕp sau hoa hång, cóc, cÈm ch−íng, lay ¬n) [2, 4]. ë ViÖt Nam, hiÖn cã rÊt nhiÒu gièng hoa ®ång tiÒn ®ang ®−îc trång víi nh÷ng −u ®iÓm: hoa to, c¸nh dµy, xÕp nhiÒu tÇng, mµu s¾c phong phó, d¸ng hoa ®Ñp, cho n¨ng suÊt cao. Tuy nhiªn, khã kh¨n trong s¶n xuÊt hoa ®ång tiÒn lµ nguån gièng cung cÊp cho qu¸ tr×nh trång trät chñ yÕu lµ c©y t¸ch th©n, mÆc dï sinh tr−ëng m¹nh trong giai ®o¹n ®Çu nh−ng ®Õn giai ®o¹n tr−ëng thµnh vµ ra hoa, c©y sinh tr−ëng chËm, nhanh giµ cçi, chÊt l−îng hoa kÐm. Bªn c¹nh ®ã, ph−¬ng ph¸p t¸ch th©n t¹o ra sè l−îng c©y kh«ng nhiÒu trong mçi lÇn nh©n gièng [2, 4]. Kü thuËt nh©n gièng v« tÝnh in vitro kh¾c phôc ®−îc nh÷ng h¹n chÕ trªn, cho phÐp chñ ®éng s¶n xuÊt ra mét l−îng lín c©y gièng, cã ®é ®ång ®Òu cao vµ chÊt l−îng tèt [1]. HiÖn nay, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu vÒ quy tr×nh nh©n gièng v« tÝnh hoa ®ång tiÒn ®−îc c«ng bè [2, 3, 4]. Tuy nhiªn, viÖc tiÕp tôc hoµn thiÖn còng nh− ®Ò xuÊt quy tr×nh kü thuËt míi cho c¸c gièng vÉn thùc sù cÇn thiÕt. II. vËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 1. VËt liÖu §èi t−îng nghiªn cøu cña ®Ò tµi lµ gièng ®ång tiÒn kÐp, hoa ®á cã nguån gèc nhËp néi. C©y gièng ®−îc trång trong nhµ l−íi, s¹ch bÖnh. 2. Xö lý mÉu Chåi ®Ønh ngän ®−îc röa trªn n−íc ch¶y vµ khö trïng s¬ bé b»ng cån 700 trong 1 phót tr−íc khi xö lý b»ng H2O2 hoÆc HgCl2. Sau khi khö trïng, chåi ®−îc röa s¹ch b»ng n−íc cÊt v« trïng 4 - 5 lÇn, c¾t lÊy mÉu cã kÝch th−íc 3 × 3 × 3mm råi NhËn bµi ngµy 22/8/2005. Söa ch÷a xong 17/11/2005 11 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 ®−a vµo m«i tr−êng dinh d−ìng nu«i cÊy trong 2 tuÇn. C¸c mÉu sèng, bËt chåi ®−îc chuyÓn sang m«i tr−êng nh©n nhanh vµ nu«i. Sau 4 tuÇn, chåi in vitro ®−îc nu«i trong m«i tr−êng t¹o rÔ 1 th¸ng tr−íc khi ®−a ra v−ên −¬m. MÉu in vitro ®−îc nu«i trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 250 ± 20C, c−êng ®é ¸nh s¸ng 2000lux, thêi gian chiÕu s¸ng 12h/ngµy [5, 6]. 3. Néi dung vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu §Ó x©y dùng quy tr×nh nh©n gièng in vitro, chóng t«i ®· tiÕn hµnh nh÷ng néi dung nghiªn cøu sau: + Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña lo¹i ho¸ chÊt, nång ®é vµ thêi gian khö trïng ®Õn tû lÖ sèng cña mÉu víi c¸c thÝ nghiÖm ®−îc bè trÝ: Khö trïng mÉu b»ng H2O2 nång ®é 10, 15 vµ 20% trong 10 - 15 phót; b»ng HgCl2 0,1% trong 5 - 15 phót. + Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng BAP (6-benzylamino purin) tíi kh¶ n¨ng nh©n chåi ®ång tiÒn in vitro. M«i tr−êng nu«i cÊy chåi ®−îc sö dông lµ [MS (Murashige and Skoog, 1962) + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar] bæ sung BAP víi c¸c nång ®é tõ 0,1 - 2,0mg/l. HÖ sè nh©n chåi trong c¸c thÝ nghiÖm ®−îc tÝnh theo c«ng thøc HÖ sè nh©n chåi = sè chåi sau thêi gian nu«i cÊy / sè chåi ban ®Çu. + Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña chÊt phô gia lµ n−íc dõa bæ sung cho m«i tr−êng nu«i cÊy víi c¸c nång ®é tõ 0 - 20% ®Õn sinh tr−ëng, ph¸t triÓn vµ hÖ sè nh©n chåi in vitro. + Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña α-NAA (α-naphtyl acetic acid) ®Õn kh¶ n¨ng ra rÔ cña chåi in vitro. M«i tr−êng ra rÔ ®−îc sö dông lµ (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar) cã bæ sung α-NAA víi c¸c nång ®é tõ 0,1 - 1,5mg/l. C¸c nghiªn cøu ®−îc thùc hiÖn tõ th¸ng 01 ®Õn th¸ng 7 n¨m 2005 t¹i Phßng Nu«i cÊy m« - tÕ bµo thùc vËt, khoa Sinh häc, tr−êng §¹i häc Vinh. III. KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn 1. ¶nh h−ëng cña lo¹i ho¸ chÊt, nång ®é vµ thêi gian khö trïng B¶ng 1. HiÖu qu¶ khö trïng ®Ønh ngän c©y ®ång tiÒn. Ho¸ chÊt Nång ®é (%) Thêi gian (phót) Sè mÉu ®−a vµo Sè mÉu nhiÔm vµ chÕt (%) Sè mÉu sèng (%) 10 10 20 15 (75) 5( 25) 15 10 20 12 (60) 8 (40) 15 15 20 12 (60) 8 (40) H2O2 20 15 20 14 (70) 6 (30) 0,1 5 20 13 (65) 7 (35) 0,1 10 20 4 (20) 16 (80) HgCl2 0,1 15 20 9 (45) 11 (55) 12 Mai V¨n Chung - Phïng V¨n Hµo, Nh©n nhanh gièng hoa ..., tr. 10-15 KÕt qu¶ b¶ng 1 cho thÊy: sö dông H2O2 ë c¸c nång ®é 10% vµ 15% ®Ó xö lý mÉu ®ång tiÒn trong thêi gian 10 phót cho tû lÖ nhiÔm kh¸ cao (tõ 60 - 75%), chøng tá hiÖu qu¶ khö trïng mÉu cña c¸c thÝ nghiÖm nµy thÊp. Khi H2O2 ®−îc sö dông víi nång ®é cao h¬n (20%) vµ kÐo dµi thêi gian xö lý (15 phót) th× sè l−îng mÉu bÞ nhiÔm cã gi¶m nh−ng tû lÖ chÕt l¹i cao. Cã thÓ nãi, H2O2 kh«ng phï hîp cho viÖc sö dông ®Ó khö trïng ®Ønh ngän ®ång tiÒn. §èi víi HgCl2 0,1%, thêi gian khö trïng 5 phót cho sè mÉu bÞ nhiÔm nhiÒu (13 mÉu). Khi t¨ng thêi gian khö trïng, tû lÖ mÉu bÞ nhiÔm vµ chÕt gi¶m nhiÒu, hiÖu qu¶ cao nhÊt ®¹t ®−îc ë c«ng thøc xö lý 10 phót (tû lÖ sèng vµ bËt chåi ®¹t 80%). Thêi gian xö lý 15 phót cho sè mÉu bÞ nhiÔm gi¶m nhiÒu (3 mÉu) nh−ng l¹i cã tíi 6 mÉu bÞ chÕt (do thêi gian xö lý dµi). Nh− vËy, sö dông HgCl2 0,1% víi thêi gian xö lý 10 phót lµ phï hîp ®èi víi ®Ønh ngän c©y hoa ®ång tiÒn. H×nh 1. Chåi ®ång tiÒn in vitro sau 1 tuÇn nu«i cÊy tõ ®Ønh ngän. 2. ¶nh h−ëng cña BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi in vitro Sau khi lùa chän ®−îc lo¹i ho¸ chÊt, nång ®é vµ thêi gian khö trïng thÝch hîp, chóng t«i ®· tiÕn hµnh xö lý mÉu víi sè l−îng lín ®Ó nh©n nhanh vµ t×m hiÓu ¶nh h−ëng cña BAP - mét lo¹i chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng thùc vËt - ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi ®ång tiÒn in vitro. B¶ng 2. ¶nh h−ëng cña BAP ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi ®ång tiÒn in vitro. Sau 2 tuÇn nu«i cÊy Sau 4 tuÇn nu«i cÊy Nång ®é BAP (mg/l) Sè mÉu Sè chåi HÖ sè nh©n Sè chåi HÖ sè nh©n 0,0 50 50 1,00 58 1,16 0,1 50 55 1,10 102 2,04 0,5 50 102 2,04 110 2,20 1,0 50 148 2,96 215 4,30 1,5 50 155 3,10 307 6,14 2,0 50 145 2,90 246 4,92 Qua b¶ng 2, chóng t«i nhËn thÊy: kh«ng cã BAP, sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn cña chåi ®ång tiÒn in vitro kÐm, hÖ sè nh©n chåi chØ ®¹t 1,16 sau 1 th¸ng nu«i cÊy. Khi bæ sung BAP vµo m«i tr−êng dinh d−ìng (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar), sinh tr−ëng cña chåi t¨ng tû lÖ thuËn víi thang nång ®é BAP tõ 0,1 - 1,5mg/l, 13 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 hÖ sè nh©n chåi cao nhÊt ®¹t ®−îc ë nång ®é BAP 1,5mg/l (sau 2 tuÇn nu«i cÊy lµ 3,10, sau 4 tuÇn lµ 6,14). TiÕp tôc t¨ng nång ®é BAP lªn 2,0 mg/l th× hiÖu qu¶ xö lý ®· gi¶m xuèng. H×nh 2. Chåi ®ång tiÒn in vitro sau 1 tuÇn cÊy chuyÓn. 3. ¶nh h−ëng cña n−íc dõa ®Õn kh¶ n¨ng sinh tr−ëng vµ nh©n chåi in vitro B¶ng 3. ¶nh h−ëng cña n−íc dõa ®Õn kh¶ n¨ng nh©n chåi ®ång tiÒn in vitro. Sau 2 tuÇn nu«i cÊy Sau 4 tuÇn nu«i cÊy Nång ®é n−íc dõa (%) Sè mÉu Sè chåi HÖ sè nh©n Sè chåi HÖ sè nh©n 0 50 94 1,88 262 5,24 5 50 110 2,20 289 5,78 10 50 152 3,04 314 6,28 15 50 193 3,86 336 6,72 20 50 141 2,82 295 5,90 N−íc dõa lµ mét lo¹i hçn hîp dinh d−ìng tù nhiªn, trong thµnh phÇn chøa nhiÒu hîp chÊt quan träng ®èi víi m«, tÕ bµo in vitro: axit amin, axit h÷u c¬, gluxit, c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh auxin, c¸c xytokinin d¹ng glycosit vµ myo insitol. Bæ sung vµo m«i tr−êng nh©n chåi ®ång tiÒn (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 1,5mg/l BAP) n−íc dõa víi nång ®é 15% cho kÕt qu¶ tèt nhÊt, chåi in vitro ph¸t triÓn m¹nh, c©y khoÎ, hÖ sè nh©n chåi ®¹t ®−îc sau 2 vµ 4 tuÇn nu«i cÊy t−¬ng øng 3,86 vµ 6,72. C¸c nång ®é cao hoÆc thÊp h¬n 15% ®Òu cho hiÖu qu¶ kÐm h¬n (b¶ng 3). Do ®ã, m«i tr−êng sö dông ®Ó nh©n nhanh chåi ®ång tiÒn cÇn bæ sung n−íc dõa víi nång ®é 15%. 4. ¶nh h−ëng cña α-NAA ®Õn kh¶ n¨ng ph¸t triÓn rÔ vµ l¸ cña chåi in vitro C¸c chåi ®ång tiÒn cã kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ ph¸t triÓn l¸ kh¸c nhau trong m«i tr−êng cã nång ®é α-NAA kh¸c nhau sau 4 tuÇn nu«i cÊy (b¶ng 4). 14 Mai V¨n Chung - Phïng V¨n Hµo, Nh©n nhanh gièng hoa ..., tr. 10-15 B¶ng 4. ¶nh h−ëng cña NAA ®Õn kh¶ n¨ng ph¸t triÓn rÔ vµ l¸ cña chåi ®ångtiÒn in vitro. Nång ®é α- NAA (mg/l) Sè chåi % sè chåi ra rÔ Sè rÔ/ c©y Dµi rÔ (mm) Sè l¸ /c©y 0,0 50 40 2,3 12,4 4,6 0,1 50 32 2,6 19,3 4,3 0,5 50 84 3,0 26,1 3,9 1,0 50 90 3,1 30,8 4,6 1,5 50 80 3,4 24,6 3,6 KÕt qu¶ thu ®−îc cho thÊy, c¸c nång ®é α-NAA tõ 0,5 - 1,5 mg/l cã ¶nh h−ëng tèt ®Õn tû lÖ ra rÔ cña chåi ®ång tiÒn in vitro (80 - 90%), sè l−îng nhiÒu (3,0 - 3,4 rÔ/c©y), chiÒu dµi rÔ lín (24,6 - 30,8mm), trong ®ã, nång ®é 1,0mg/l α-NAA cho hiÖu qu¶ tèt nhÊt. ë nång ®é nµy, mÆc dï sè rÔ/c©y ch−a ph¶i lµ nhiÒu nhÊt nh−ng tû lÖ c©y ra rÔ, chiÒu dµi rÔ vµ sè l¸/c©y lµ cao h¬n c¶. V× vËy, theo chóng t«i, nång ®é α-NAA bæ sung vµo m«i tr−êng (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar) cho chåi ®ång tiÒn in vitro ra rÔ thÝch hîp nhÊt lµ 1,0mg/l. H×nh 3. C©y ®ång tiÒn sau 4 tuÇn nu«i trong m«i tr−êng ra rÔ. IV. kÕt luËn Tõ nh÷ng kÕt qu¶ thu ®−îc, b−íc ®Çu, chóng t«i ®Ò xuÊt ph−¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh in vitro gièng ®ång tiÒn kÐp, hoa ®á nh− sau: + Chåi ®Ønh ngän tr−íc khi ®−a vµo nu«i cÊy in vitro ®−îc khö trïng kÐp: xö lý mÉu b»ng cån 700 (1 phót), sau ®ã sö dông HgCl2 0,1% trong 10 phót. + M«i tr−êng nh©n nhanh chåi ®ång tiÒn in vitro MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% n−íc dõa. + M«i tr−êng t¹o rÔ cho chåi ®ång tiÒn in vitro: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l α-NAA. 15 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 Tµi liÖu tham kh¶o [1] Lª TrÇn B×nh, Hå H÷u NhÞ, Lª ThÞ Muéi, C«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c¶i tiÕn gièng c©y trång, NXB N«ng nghiÖp, Hµ Néi, 1997. [2] §Æng V¨n §«ng, §inh ThÕ Léc, Hoa ®ång tiÒn, NXB Lao ®éng - X· héi, Hµ Néi, 2004. [3] TrÇn ThÞ LÖ, Lª Dung, Hoµn thiÖn quy tr×nh nh©n gièng c©y hoa ®ång tiÒn b»ng c«ng nghÖ in vitro, T¹p chÝ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n, Sè 10 (2005), 80 - 82. [4] NguyÔn Xu©n Linh, Hoa vµ kü thuËt trång hoa, NXB N«ng nghiÖp, Hµ Néi, 1998. [5] §ç N¨ng VÞnh, C«ng nghÖ sinh häc c©y trång, NXB N«ng nghiÖp, Hµ Néi, 2002. [6] M. R. Fowler, Plant cell culture, laboratory techniques, In Encyclopedia of cell, Wiley, New York, 2002. SUMMARY Rapid multiplication of Gerbera (Gerbera jamesonii B.) by tissue culture technique We have studied to apply the technique of in vitro propagation in order to produce a large number of disease-free plantlet of Gerbera. The first results of our research show that: The in vitro shoot tip explants of Gerbera were sterilized by etanol 700 in 1 minute and HgCl2 0.1% in 10 minutes; The best medium using for shoot multiplication is [MS (Murashige and Skoog, 1962) + 50g/l saccharose + 6.5 g/l agar + 1.5mg/l BAP (6-benzylaminopurine) + 15% coconut water]; The best medium using for roots formation was (MS + 50g/l saccharose + 6.5 g/l agar + 1.0 mg/l α-NAA (α-naphtyl acetic acid)). (a) (b) Khoa sinh häc, Tr−êng §¹i häc Vinh 16 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 17 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 18 NguyÔn V¨n Dòng, Vµi nhËn xÐt vÒ kh«ng gian ..., tr. 16-22 19 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 20 NguyÔn V¨n Dòng, Vµi nhËn xÐt vÒ kh«ng gian ..., tr. 16-22 21 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 22 NguyÔn V¨n Dòng, Vµi nhËn xÐt vÒ kh«ng gian ..., tr. 16-22