Phương pháp SSR

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN: KĨ THUẬT DI TRUYỀN TS: Trần Thị Dung Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Dung-61203022 Nguyễn Kim Dung-61203023 Nguyễn Hoàng Thêm-61203134 Chủ đề: PHƯƠNG PHÁP SSR NỘI DUNG KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SSRs ĐẶC ĐIỂM CƠ CHẾ ĐỘT BiẾN HÌNH THÀNH MICROSATELLITES CÁC LOẠI SSRs PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MICROSATELLITES (SSRs) PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MICROSATELLITES (SSRs) NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA MICROSATELLITES ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP MICROSATELLITES TÀI LIỆU THAM KHẢO I.KHÁI NIỆM: Microsatellite là những trình tự đặc biệt của DNA mà có chứa sự lặp lại nối tiếp   từ 2 đến 6 bp còn gọi là SSR (simple sequence repeats), STR (short tandem repeats), VNTR (variable number of tandem repeats). Ví dụ: GTGTGTGTGTGT hay (GT)6 CTGCTGCTGCTGCTG hay (CTG)5 ACTCACTCACTCACTC hay (ACTC)4 II.ĐẶC ĐIỂM: Microsatellite là marker được lựa  chọn trong việc lập bản đồ phân tử, sự xác định những giống cây trồng, đánh giá nguồn gốc tổ  tiên của cây trồng cho mục đích nghiên cứu quần thể cây trồng và sự tiến hóa là vì   Có tính đa alen và biến dị cao  Là marker đồng trội  Phân bố ngẫu nhiên khắp bộ gen sinh vật  Dễ dàng xác định bằng PCR sử dụng các primer đặc biệt. Một cá  thể có một locus đồng hợp sẽ có cùng số  lần lặp lại trên cả hai nhiễm sắc thể, trong khi một cá thể dị hợp sẽ có số  lần lặp lại khác nhau trên hai nhiễm sắc thể. Những vùng xung quanh locus của microsatellite,  được gọi là  vùng hai bên (flanking region) có  thể có cùng trình tự. Điều này rất quan trọng bởi vì những vùng hai bên có  thể  được dùng như  primer của phản  ứng PCR khi nó  sẽ  khuếch  đại microsatellite, và vùng hai bên này sẽ bảo tồn giữa các giống hay thỉnh thoảng giữa các họ.   (SSRs có thể được khuếch đại để xác định phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) quá trình, bằng cách sử dụng chuỗi duy nhất DNA liên tục bị làm biến tính ở nhiệt độ cao để tách các sợi đôi, sau đó làm lạnh để cho phép ủ mồi và phần mở rộng của trình tự nucleotide thông qua SSRS Quá trình này cho kết quả nhìn thấy trên gel agarose hoặc polyacrylamide , chỉ một lượng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại bởi vì theo cách này thermocycling tạo ra một sự gia tăng theo cấp số nhân trong phân đoạn nhân rộng. NGUYÊN LÝ CỦA SSR MARKER Dựa vào hai đầu (vùng sườn) của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc biệt và thống nhất chung cho cùng một đoạn DNA trên gen không phân biệt cá thể trong cùng một loài, nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số lần lặp lại của đơn vị lặp lại là khác nhau. Từ đó, thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các cặp DNA trên gen chứa các trình tự lặp lại. Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và khác nhau giữa các cá thể trong cùng loài. III. CƠ CHẾ ĐỘT BIẾN HÌNH HÀNH MICROSATELLITE Cơ chế đột biến hình thành Microsatellites vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên có hai giả thuyết được nhiều người chấp nhậm là do 1) quá trinh bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân và 2) quá trình trượt lỗi trong quá trình sao mã. 1. Sự trượt lỗi của polymerase (Polymerase slippage)    -Khi DNA tái bản, enzyme polymerase không tìm thấy vị trí của nó và cắt bớt đơn vị lặp lại hay thêm vào quá nhiều đơn vị lặp lại. Kết quả là sợi mới có số lần lặp lại khác với sợi bố mẹ. Điều này giải thích cho những sự thay đổi nhỏ trong số lần lặp lại (thêm vào hoặc bớt đi một hay nhiều lần lặp lại).   -Sự  trượt lỗi có  thể  khuếch  đại những trình tự  lặp lại ngắn  này thành nhiều lần lặp lại qua các thế hệ kế  tiếp.   -Bên cạnh đó, hiệu quả của hệ  thống sửa chữa cho sự bắp cặp sai cũng đóng một vai trò quan trọng trong tốc độ biến đổi của microsatellite. 2. Sự bắt cặp không đồng đều trong giảm phân Cơ chế này giải thích cho những thay đổi lớn hơn trong số  lần lặp lại. Trong sơ đồ dưới, nhiễm sắc thể A có quá nhiều sự lặp lại, và nhiễm sắc thể B thì có quá ít sự lặp lại.   Nguyên nhân tồn tại của microsatellite -Microsatellite là DNA vô nghĩa, và sự biến đổi phần lớn không có tính chất rõ rệt.Chúng thường không có  tác  động có  thể  đo lường  được trên kiểu hình, và  khi chúng  đột biến, thông thường là  gây hại và  không có  lợi.  Ở  người, 90% những microsatellite đã biết được tìm thấy trong vùng không mã hóa của bộ gen. Khi tìm thấy ở vùng mã hóa ở người, microsatellite được biết là gây bệnh. Thú vị  là khi tìm thấy trong vùng mã hóa, microsatellite thường là sự  lặp lại ba nucleotide. Sự giải thích có thể là do những dạng nucleotide lặp lại khác sẽ gây hại nhiều cho vùng mã hóa, vì nó sẽ gây ra sự đột biến xê dịch khung. Microsatellite cung cấp nguồn cần thiết cho sự đa dạng di truyền. Ở vi khuẩn, sự biến đổi alen của microsatellite trong vùng mã hóa được cho là để  thích nghi với những môi trường khác nhau. Nghĩa là một alen ngắn có  thể  thích nghi với một môi trường, và một alen dài với nhiều lần lặp lại có thể thích nghi với một môi trường khác. Đặc biệt là, sợi nhỏ  protein ngắn có  thể  làm cho vi khuẩn  ít  nhớt, và một sợi nhỏ protein dài hơn có thể làm nó dính hơn và gây bệnh hơn (Moxon và Wills, 1999). Do đó, có sự đa dạng trong quần thể sẽ đảm bảo sự sống sót của quần thể vi khuẩn trong những môi trường khác nhau. Tương tự, Kashi và Soller (1999) tin rằng sự đa dạng của microsatellite có thể là một cách để đền bù cho sự mất đi tính đa dạng di truyền do bởi sự chọn lọc di IV. CÁC LOẠI SSRs Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần – dinucleotide repeat) chúng ta có tri nucleotide loại di nucleotide được tìm thấy nhiều ở động vật có vú chủ yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT, AT/TA Chúng ta có thể phân ra làm 3 loại (hoàn hảo không có sự ngắt quãng trong trình tự phối hợp và ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại, ngắt quãng bị chèn bởi 1 hay nhiều base. i). Satellites là đoạn trình tự lặp lại 1 lần mà có thể cấu tạo tới vài phần trăm của genome có thể lớn tới 5 Mb. Satellites thường tập trung ở vùng tâm động của nhiễm sắc thể do đó nó it khi được sử dụng trong phân biệt kiểu gen của các cá thể mà được sử dụng nhiều trong quá trình lập bản đồ gen ở gần vùng tâm động ii). Minisatellites có mặt tại hàng trăm hoặc hàng nghìn vị trí khác nhau trên gennome mà ở đó một đơn vị lặp lại từ 10 bp cho tới 0,5-30 kb. Để phát hiện ra minisatellite người ta có thể dùng phương pháp mẫu dò phóng xạ. Những thông tin này có thể tạo nên thông tin đặc biệt riêng cho từng cá thể như kiểu "dấu vân tay" ở người. Nó được sử dụng để xác định quan hệ trong gia đình và nguồn gốc của các mẫu vật iii). Microsatellite là các đoạn lặp lại ngắn 2-6bp và kích thước mỗi locus là 20-100 bp. Microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân bố đều trên genome. Các thông tin về đa allen của một locus cũng như trên nhiều locus cùng một lúc có thể được phân tích một cách đơn giản và nó có thể đủ lớn cho các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, hệ phả, khoa học hình sự. Microsatellite có tính đa hình rất cao (chiều dài) là những allen đồng trội nó có các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến lớn, nó tuân theo định luật menden, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể có thể xác định được bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. IV. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MICROSATELLITES (SSRs) Để tìm và xác định Microsatellites ta có một số các thủ tục xác định như sau: 1.Cắt nhỏ ADN genome bằng các enzym giới hạn. 2.Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gen thạch agarose 1%, phân tách các đoạn từ 300- 500bp 3. Chuyển lên màng lai (nylon membral) theo nguyên tắc southernblot. 4. Dùng các mẫu dò là các đoạn ADN đã được đánh dấu cho lai ghép với màng lai, các mẫu dò là các trình tự ADN tương ứng với trình tự Microsatellite mà chúng ta quan tâm. 5. So sánh và khôi phục các vạch AND tương ứng với Microsatellite mà chúng ta quan tâm 6. Chuyển vào một vector sequencing. 7. Sequencing và xác định SSR cũng như trình tự ADN nằm ngoài trình tự SSR, đây là vùng để thiết kế mồi 8. Tổng hợp mồi và kiểm tra sự đa hình của Microsatellite. kích thước của các alen chỉ khác nhau từ hai nucleotide trở lên mặt khác trong quá trình tổng hợp PCR, polymeraza có thể tạo thêm hoặc có thể bỏ sót một đơn vị lặp lại một nucleotide A nữa. Do vậy để xác định kích thước các alen đòi hỏi quá trình điện di phải dùng gel có độ phân tách cao Tạo Microsatellites mồi: -Nếu biết được vị trí cụ thể của bộ gen, ví dụ như trong một exon của một gen, mồi có thể được thiết kế bằng tay. -Mồi SSR ngẫu nhiên có thể được phát triển bởi các phân đoạn nhân bản ngẫu nhiên của DNA từ các loài đầu mồi. -Các phân đoạn này ngẫu nhiên được đưa vào một plasmid hoặc vi khuẩn vector ,sau đó được cấy vào vi khuẩn ecoli. VI. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA MICROSATELLI Trong chuẩn đoán bệnh: - Vì ADN Microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự phát triển của một số bệnh ung thư, chúng là những marker rất hữu ích trong việc dò tìm, phát hiện ung thư sớm. Bởi vì tính đa hình của chúng hữu ích trong sự nghiên cứu các liên kết để định vị những Gen chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật tự di truyền học Nghiên cứu quần thể : - ADN Microsatellite có thể được sử dụng để phát hiện ra thay đổi đột ngột trong quần thể, hiệu ứng của sự phân đoạn quần thể và sự tương tác của những quần thể khác nhau. Microsatellite hữu ích trong sự nhận ra của những quần thể phôi thai và quần thể mới VIII. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP Ưu điểm -Thuận lợi to lớn của sự phân tích microsatellite là phương pháp này biểu hiện số  lượng lớn sự đa hình. Một  locus ở đậu nành (Glycine max) được báocáo là có 26 alen . Hơn nữa, khá năng phân biệt các cá thể khi có  sự kết hợp các  locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữ dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gen, xác định cây trồng và phân tích mốiquan hệ cha con . -Microsatellite là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định. Tính đồng trội của microsatllite sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác, như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn -Khi các primer SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kỹ  thuật này hoàn toàn không đắt tiền. Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là  sự  xác  định những primer SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần. Ví dụ, ba bộ primer microsatellite đã được thiết kế ở Malus domestica (Rosaceae), các microsatellite này cung cấp 35 loci, trong số đó  có  những primer có  thể  khuếch  đại các  loài Malus khác  2.Hạn chế Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ  thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại. Thứ nhất: Trình tự vùng flanking ở 2 bên vùng microsatellite thường khác nhau giữa các loài do đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer microsatellite của loài này cho loài khác. Thứ hai,: Do tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC19, chúng ta cũng không thể kết luận  rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ  tổ  tiên của chúng là AC18  rồi đột biến thành AC19, còn 1 loài phân ly từ  tổ tiên của chúng là AC20 rồi đột biến thành AC19. 40 IX.TÀI LIỆU THAM KHẢO   Phạm Văn Duệ, 2005. Giáo trình kỹ thuật trồng cây ăn quả. Nhà xuất bản Hà Nội. Trang 105.   – XEM THÊM TẠI: