Phương pháp xác định trình tự ADN

Là các phương pháp dùng để xác định trình tự sắp xếp các nucleotides trong một chuỗi hoặc 1 đoạn DNA. Sử dụng các phương pháp : Maxam-Gilbert (1977) Sanger (1977) Xác định trình tự tự động Phương pháp xác định trình tự ADN I.Phương pháp Maxam-Gilbert 1.Nguyên lý Là phương pháp phân giải hóa học (do Allan Maxam vµ Walter Gilbert ë ®¹i häc Haward ®· ®Ò xuÊt n¨m1977). Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau 1 nucleotid. §iÖn di c¸c ®o¹n ADN nµy vµ nhËn biÕt vÞ trÝ cña chóng nhê ®¸nh dÊu phãng x¹. Dùa vµo ®ã ®Ó ®äc ®­îc tr×nh tù cña ADN 2. C¸c b­íc tiÕn hµnh Chuçi ADN kÐp ®­îc ®¸nh dÊu phãng x¹ víi 32P t¹i ®Çu cuèi 5’ nhê enzym polynucleotit kinase vµ 32P - dATP Dïng dimethyl sunphoxit ®un nãng ®Õn 90 0C ®Ó t¸ch ADN thµnh 2 sîi ®¬n vµ ®iÖn di t¸ch dêi tõng lo¹i s¬i ®¬n C¸c sîi ®¬n ®­îc chia thµnh 4 mÉu riªng rÏ vµ ®­îc xö lý víi c¸c ho¸ chÊt ®Æc hiÖu ®Ó ph¸ háng 1 hay 2 trong 4 baz¬ nit¬: Dimethylsun phat ph¸ háng G Glicosidic ph¸ háng A+G Hydrazin ph¸ háng C+T hydrazin + NaCl ph¸ háng C  I.Phương pháp Maxam-Gilbert Phương pháp Maxam-Gilbert Xö lý tiÕp c¸c mÉu nµy víi piperidin ®Ó bÎ gÉy ADN t¹i vÞ trÝ baz¬ nit¬ ®· bÞ ph¸ háng ĐiÖn di riªng rÏ 4 mÉu trªn cïng 1 gel ®iÖn di, lµm phim phãng x¹ tù ghi và ®äc vÞ trÝ cña c¸c nucleotit lÇn l­ît trªn 4 mÉu tõ cùc d­¬ng cña gel lªn cùc ©m theo nguyªn t¾c: ®o¹n ADN cµng ng¾n cµng dÞch chuyÓn xa so víi ®iÓm xuÊt ph¸t ban ®Çu trªn b¶n ®iÖn di ®å. Ví dụ Đoạn mạch đơn ADN đánh dấu đầu 5‘ ở nucleotid A có trình tự: P32 TAGTCGCAGT3‘ Xử lý G: tạo 3 đoạn Xử lý A+G: tạo 5 đoạn Xử lý T+C: tạo 5 đoạn Xử lý C: tạo 2 đoạn II.Phương pháp Sanger 1.Nguyên lý Phương pháp enzym (do Frederick Sanger ®Ò xuÊt 1977 ) Dựa vào hoạt động của enzym ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN. Enzym này xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra các đoạn AND chênh lệch nhau 1 nucleotid §iÖn di c¸c ®o¹n ADN nµy vµ nhËn biÕt vÞ trÝ cña chóng nhê ®¸nh dÊu phãng x¹. Dùa vµo ®ã ®Ó ®äc ®­îc tr×nh tù cña ADN Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotit (phương pháp dideoxynucleotid) Phương pháp Sanger 2.Cách tiến hành: C¾t ADN b»ng enzym c¾t giíi h¹n, t¸ch c¸c ®o¹n ADN ®· c¾t thµnh sîi ®¬n vµ nh©n dßng ( cloning ) chóng ( l­îng ADN > g ) b»ng vet¬ m¹ch ®¬n: phage M13 ®Ó t¹o ®ñ ADN lµm nguyªn liÖu nghiªn cøu TiÕn hµnh ®ång thêi 4 ph¶n øng tæng hîp riªng rÏ cho ®o¹n ADN nghiªn cøu b»ng ph­¬ng ph¸p tæng hîp nhê enzym AND-polymerase vµ trong mçi ph¶n øng cã sù tham gia cña l­îng nhá (1% ) 1 lo¹i ddNTP vµ c¸c ®o¹n måi ®· ®­îc ®¸nh dÊu phãng x¹ 32P hay 35S Ch¹y ®iÖn di ®Ó t¸ch c¸c ®o¹n ADN ®· tæng hîp ®­îc trong mçi ph¶n øng. §iÖn di riªng rÏ kÕt qu¶ cña 4 ph¶n øng trªn cïng 1 b¶n gel. Lµm phim phãng x¹ tù ghi cho b¶n gel ®iÖn di vµ ®äc tr×nh tù cña nucleotit trªn ®iÖn di ®å lÇn l­ît trªn c¶ 4 mÉu tõ cùc ©m b¶n gel lªn cùc d­¬ng theo nguyªn t¾c: ®o¹n ADN cµng ng¾n cµng dÞch chuyÓn xa so víi ®iÓm xuÊt ph¸t ban ®Çu trªn b¶n ®iÖn di ®å. Bất lợi của phương pháp đánh dấu phóng xạ Đánh dấu 32P:chu kì bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh, do năng lương cao của tia xạ nên tín hiệu không nét Đánh dấu 35S: chu kì bán rã dài (2-3 tháng), năng lượng của tia xạ thấp nên làm giảm độ nhạy của các phân tích Manual sequencing method III.Xác định trình tự bằng phương pháp tự động  Nguyªn t¾c chung cña gi¶i tr×nh tù gen tù ®éng lµ dùa theo c¬ së cña ph­¬ng ph¸p Sanger. Nh­ng : Qu¸ tr×nh tæng hîp AND thùc hiÖn nhê kú thuËt PCR Mçi ddNTP ®­îc ®¸nh dÊu b»ng mét lo¹i fluochrom cã mµu kh¸c nhau nªn cã thÓ tiÕn hµnh c¶ 4 ph¶n øng tæng hîp trong cïng mét èng nghiÖm vµ ®iÖn di trªn 1 b¨ng §äc kÕt qu¶ ®iÖn di tù ®éng nhê tia laze vµ phÇn mÒm xö lý sè liÖu Figures taken from