Quy trình lên men acid citric từ aspergillus niger

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 6 LỚP DH11SH QUY TRÌNH LÊN MEN ACID CITRIC TỪ Aspergillus niger SEMINAR MÔN CÔNG NGHỆ LÊN MEN Khóa học: 2010 - 2014 An Giang, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 6 LỚP DH11SH QUY TRÌNH LÊN MEN ACID CITRIC TỪ Aspergillus niger SEMINAR MÔN CÔNG NGHỆ LÊN MEN Khóa học: 2010 - 2014 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ThS. Nguyễn Phú Thọ DANH SÁCH NHÓM 1. Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh 2. Bung San Ny Thanh Hồng Anh 3. Hoàng Nguyễn Trung Nghĩa 4. Nguyễn Viết Thanh 5. Lê Hoàng Yên 6. Nguyễn Ngọc Hồ 7. Nguyễn Phạm Toại Nguyện An Giang, 2013 i Mục lục Nội dung Trang Mục lục ................................................................................................................ i Danh sách hình ..................................................................................................iii Danh sách bảng ................................................................................................. iv Chương 1 Đặt vấn đề ....................................................................................... 1 Chương 2 Tổng quan về acid citric ................................................................ 2 2.1. Khái quát ..................................................................................................... 2 2.2. Tên gọi ........................................................................................................ 3 2.3. Tính Chất ..................................................................................................... 3 Chương 3 Tổng quan về công nghệ sản xuất acid citric ............................... 4 3.1. Yêu cầu đối với nguyên liệu lên men acid citric ......................................... 4 3.2. Một số nguyên liệu gluxit ........................................................................... 4 3.2.1. Mật rỉ ........................................................................................................ 4 3.2.2. Tinh bột sắn .............................................................................................. 5 3.2.3. Ngô ........................................................................................................... 5 3.3.3. Phân tích chọn nguyên liệu thích hợp cho việc sản xuất acid citric ........ 5 3.3. Vi sinh vật ................................................................................................... 5 3.4. Cơ sở lý thuyết và cơ chế hình thành acid nitrit ......................................... 6 3.4.1. Cơ sở lý thuyết của quy trình lêm men acid citrit .................................... 6 3.4.2. Cơ chế hình thành acid citric.................................................................... 6 3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất acid citric ............................ 6 3.5.1. Vi sinh vật ................................................................................................ 6 3.5.2. Nguyên liệu .............................................................................................. 6 3.5.3. Môi trường dinh dưỡng ............................................................................ 7 3.5.4. pH môi trường .......................................................................................... 7 3.5.5. Sự thoáng khí ........................................................................................... 7 3.6. Các yếu tố quyết định đến quá trình sản xuất acid citric ............................ 7 3.6.1. Môi trường th c n ................................................................................... 7 ii 3.6.2. Môi trường lên men .................................................................................. 7 3.6.3. ự thoáng khí ........................................................................................... 7 3.6.4. nh hưởng của nhiệt độ ........................................................................... 8 3.6.5. Thời gian lên men .................................................................................... 8 Chương Công nghệ ản ấ ac c c ...................................................... 9 4.1. Công nghệ sản uất acid citric .................................................................... 9 4.1.1. Nuôi cấy nấm mốc nuôi cấy trong ph ng thí nghiệm và nhân giống trong sản uất .................................................................................................... 9 4.1.2. Chu n bị dịch lên men.............................................................................. 9 4.1.3. Lên men .................................................................................................... 9 4.1.4. Tách nấm mốc ........................................................................................ 10 4.1.5. Tạo can i citrat ....................................................................................... 10 4.1.6. Tách can i citrat ..................................................................................... 10 4.1. . ấy dung dịch acid citric trong thiết bị sấy chân không ........................ 11 4.1. . Kết tinh và sấy khô acid citric ................................................................ 11 4.2. Sản xuất acid citric bằng nấm mốc Aspergillus niger ............................... 11 4.2.1. Môi trường lên men ................................................................................ 11 4.2.3. Quá trình lên men ............................................................................... 12 4.2.4. Thu hồi và tinh chế acid citric ............................................................ 12 Chương 5 Ứng dụng của acid citric trong thực phẩm và công ngh ệp ..... 15 5.1. Trong thực ph m ....................................................................................... 15 5.2. Trong công nghiệp .................................................................................... 15 Chương 6 Kết luận và k ến nghị ................................................................... 16 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 16 5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 16 Tà l ệu tham khảo ......................................................................................... 17 iii Danh ách hình Nội dung Trang Hình 1: Một số sản ph m ch a acid citric.......................................................... 2 Hình 2: Công th c cấu tạo của acid citric .......................................................... 3 Hình 3: Một số loại trái cây rất giàu hàm lượng acid citric cần dùng cho lên men ..................................................................................................................... 4 Hình 4: Aspergilus niger .................................................................................. 11 Hình 5: Tinh thể acid citric .............................................................................. 13 Hình 6: ơ đồ quy trình sản xuất acid citric bằng nấm Aspergillus niger ....... 14 iv Danh ách bảng Nội dung Trang Bảng 1: Thành phần môi trường sử dụng trong ph ng thí nghiệm và trong sản xuất acid citric bằng nấm mốc Aspergillus niger. ............................................ 11 1 Chương 1 Đặt vấn đề Được xem là một chất bảo quản tự nhiên và cũng như được sử dụng để bổ sung vị chua cho thực ph m hay các loại nước ngọt. Acid citric là một trong những loại acid hữu cơ có nhiều ng dụng gần gủi trong đời sống và bên đó là ng dụng khá nhiều của acid citric trong công nghiệp. Trong sinh hoá, là tác nhân trung gian quan trọng trong chu trình acid citric và vì thế xuất hiện trong trao đổi chất của gần như mọi sinh vật, được coi là tác nhân làm sạch tốt về mặt môi trường và đóng vai tr của chất chống ô i hóa, các lượng acid citric dư thừa dễ dàng trao đổi và bài tiết ra khỏi cơ thể. Chính vì tầm quan trọng và có nhiều ng dụng của acid citric như thế nên chúng ta tiến hành tìm hiểu quá trình lên men acid citric từ nấm mốc Aspergillus niger từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như mật rỉ, tinh bột sắn, ngô,… thu hồi acid citric nhiều hơn và hạn chế sử dụng các loại hoá chất tổng hợp hoá học gây hại trong thực ph m cho con người. 2 Chương 2 Tổng quan về acid citric 2.1. Khá q á Acid citric là một acid hữu cơ phổ biến trong thực vật nó có nhiều trong nước chanh 6% , nước lựu (9%), trong quả cam, quýt, d a, dâu tây,… Acid citric được dùng nhiều trong công nghiệp thực ph m làm nước giải khát, bánh kẹo, đồ hộp, trong y dược, dệt, nhuộm, nghề ảnh, nghề in... Nước cam Nước chanh Nước lựu Nước d a Hình 1: Một số sản phẩm chứa acid citric Acid citric có công th c chung là C6H8O7. Acid citric là sản ph m kết tinh trong suốt, không màu hoặc ở thể rắn dạng viên màu trắng; điểm nóng chảy 153 0 C, tỷ trọng 1.542; ở 1000C bị dung giải; ở trong 1500C bị bay hơi thành acid citric khan. 3 2.2. Tên gọi Tên theo IUPAC: Axit 2-hydroxypropan-1,2,3-tricacboxylic Tên thông thường: Axit chanh Công th c phân tử: C6H8O7 Khối lượng phân tử: 192.13 g/mol Có dạng: Tinh thể mà ắng Nhiệt độ nóng chảy: 1530C Nhiệt độ sôi: 175oC (phân hủy) Hình 2: Công thức cấu tạo của acid citric (Nguồn: 2.3. Tính Chất Tính acid của a it citric là do ảnh hưởng của nhóm carbo yl - COOH, mỗi nhóm carbo yl có thể cho đi một proton để tạo thành ion citrat. Các muối citrat dùng làm dung dịch đệm rất tốt để hạn chế sự thay đổi pH của các dung dịch acid. Các ion citrat kết hợp với các ion kim loại để tạo thành muối, phổ biến nhất là muối can i citrat dùng làm chất bảo quản và giữ vị cho thực ph m. Bên cạnh đó ion citrat có thể kết hợp với các ion kim loại tạo thành các ph c dùng làm chất bảo quản và làm mềm nước. Ở nhiệt độ ph ng thì acid citric tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng dạng bột hoặc ở dạng khan hay là dạng monohydrat có ch a một phân tử nước trong mỗi phân tử của acid citric. Dạng khan thu được khi acid citric kết tinh trong nước nóng, trái lại dạng monohydrat lại kết tinh trong nước lạnh. Ở nhiệt độ trên 40C dạng monohydrat sẽ chuyển sang dạng khan. Về mặt hóa học thì acid citric cũng có tính chất tương tự như các acid carbo ylic khác. Khi nhiệt độ trên 1 50C thì nó phân hủy tạo thành CO2 và nước. 4 Chương 3 Tổng quan về công nghệ sản xuất acid citric Trước kia acid citric chỉ được sản xuất từ chanh, nhưng giá thành cao, hiệu suất thu hồi thấp. Hiện nay người ta dùng phương pháp o y hoá glu it để tạo thành acid citric nhờ nấm mốc, hơn 90% acid citric được sản xuất theo phương pháp lên men. Hình 3: Một số loạ á cây ấ g à hàm lượng acid citric cần ùng cho lên men 3.1. Yê cầ đối vớ ng yên l ệ lên men ac c c Nguyên liệu phải đảm bảo đủ lượng đường cho vi sinh vật phát triển. Giống vi sinh vật dùng trong sản xuất acid citric phải đảm bảo các yêu cầu sau:  Có khả n ng tạo acid citric rất mạnh.  Có khả n ng chịu được môi trường acid khi lượng acid citric t ng cao.  Ít tạo ra những acid hữu cơ khác như: acid o alic, acid gluconic, acid fumaric. 3.2. Một số ng yên l ệu gluxit 3.2.1. Mật rỉ Mật rỉ là một phụ ph m của ngành sản xuất đường, là sản ph m cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không c n có thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông thường. Thành phần chính của mật rỉ là đường, chủ yếu là sucroza với một ít glucoza và fructoza. Nói chung, sản lượng mật rỉ bằng khoảng 1/3 sản lượng đường sản xuất. C khoảng 100 tấn cây mía đem ép thì có 3 - 4 tấn rỉ mật được sản xuất. 5 3.2.2. Tinh bột sắn Độc tố trong sắn có tên chung là Phazeolunatin ch a nhiều trong sắn đắng, chủ yếu ở vỏ và cùi, hàm lượng của Phazeolunatin vào khoảng 0,001 - 0,04%. Phazeolunatin không độc nhưng khi bị thủy phân thì các glucozit này sẽ giải phóng HCN, là một chất gây độc cho cơ thể. Tuy nhiên dễ bay hơi và dễ h a tan trong nước lạnh hay nước vơi nên dễ loại bỏ. Sắn thái lát, phơi khô giảm đáng kể số lượng HCN. 3.2.3. Ngô Hạt ngô gồm hai phần chính: Phôi và nội nhũ. Phôi chiếm 10 - 13% trọng lượng hạt, nội nhũ chiếm 83 - 85%, vỏ chiếm 2 - 5%. 3.3.3. Phân ích chọn ng yên l ệu hích hợp cho việc sản xuất acid citric Hàm lượng glu it có trong ngô là cao nhất (67,9%), tiếp đến là mật rỉ, khoai lang, sắn, và cuối cùng là khoai tây. Tuy nhiên bản chất của lên men citric là quá trình o y hóa đường thành acid citric dưới tác dụng của vi sinh vật mà trong các nguyên liệu tinh bột (ngô, sắn, khoai,…) muốn sản xuất ra acid citric cần phải trải qua giai đoạn thủy phân tinh bột thành đường, từ đường dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành acid citric rất mất nhiều thời gian và chi phí, trong khi đó mật rỉ thành phần hóa học chủ yếu là đường vi sinh vật sẽ trực tiếp sử dụng đường để tạo thành acid citric. Mặt khác mật rỉ là nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm do đó mật rỉ là nguyên liệu được sử dụng nhiều hơn trong việc sản xuất acid citric, tuy nhiên cần xử lí mật rỉ trước khi sử dụng vì trong mật rỉ ch a chất màu, hệ keo, đặc biệt là kim loại nặng ảnh hưởng đến quá trình lên men, c chế vi sinh vật phát triển. 3.3. Vi sinh vật Aspergillus niger là một loại nấm sợi và là một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus có nhiều ng dụng trong công nghệ sinh học, nhiệt độ tối ưu ở 35 - 370C, pH từ 1,4 - 9, . Nó gây ra một c n bệnh được gọi là nấm mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực ph m. Aspergillus niger là vi sinh vật hiếu khí phát triển trên các chất hữu cơ, do đó nó có thể được tìm thấy gần như ở khắp mọi nơi trong môi trường có ch a đất. Ngoài ra, nó được tìm thấy trong chất thải, nguyên liệu thực vật phân hủy và phân hữu cơ trong môi trường ngoài trời. Môi trường m trong nhà tạo ra một môi trường sống tốt cho sự phát triển của nấm mốc. Chẳng hạn như trong các lĩnh vực hộ gia đình thông thường, trên các b c tường trong ph ng tắm hoặc các khu vực khu vực khác có mositure. 6 3.4. Cơ ở lý h yết và cơ chế hình hành ac n 3. .1. Cơ ở lý h yết của q y ình lêm men ac c Trong quá trình này glucose được chuyển hoá thành a it pyruvic theo con đường EMP (Embden-Mayerhof-Parnas , sau đó a it pyruvic tiếp tục chuyển hoá thành a it citric. Phương trình tổng quát của quá trình này như sau: 2C6H12O6 + 3O2 → 6C6H8O7 + 4H2O Glucose Acid citric Các loại vi sinh vật để sản xuất acid citric: Aspergillus niger, Aspergillus clavarus, Penicillium citrinum, Mucor piriformis và những loài Mucor khác. Những chủng Aspergillus cho kết quả cao nhất. 3.4.2. Cơ chế hình hành ac c c Phương trình chung của quá trình chuyển hoá đường thành acid citric là: 2C6H12O6 + 3O2 → 2C6H8O7 + 4H2O Cơ chế của sự chuyển hoá này có thể được biểu diễn như sau: Đường C6H12O6 thuỷ phần thành acid pyruvic CH3COCOOH) CH3COCOOH + CO2 → HOOCCH2COCOOH Acid oxaloacetic HOOCCH2COCOOH + CH3COOH → CH2COOHCOHCOOHCH2COOH Acid citric 3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến q á ình ản xuất acid citric 3.5.1. Vi sinh vật Vi sinh vật đóng vai tr quan trọng trong quá trình lên men. Do đó cần lựa chọn vi sinh vật phù hợp cho quá trình lên men citric, thông thường để quá trình tổng hợp acid citric xảy ra mạnh thì vi sinh vật phải có khả n ng tạo ra acid cao, nếu khả n ng tạo ra acid của vi sinh thấp thì không thể sản xuất ra một lượng lớn acid citric được; mặt khác vi sinh vật phải có khả n ng chịu được acid khi lượng acid t ng cao nếu không trong quá trình lên men acid hình thành lớn vi sinh vật sẽ chết và sẽ c chế khả n ng tạo acid citric, ngoài ra chủng vi sinh vật sử dụng cần phải ít tạo ra những acid hữu cơ khác như: acid o alic, acid gluconic, acid fumaric vì nếu các acid này hình thành nhiều sẽ gây ảnh hưởng đến chất lượng của acid citric. 3.5.2. Ng yên l ệu Nguyên liệu thích hợp cho sản xuất acid citric là nguyên liệu ch a nhiều đường ví dụ: mật rỉ,... vì sinh vật sẽ o i hóa đường để tạo thành acid citric, Nồng độ axit citric cao nhất đạt được nếu phát triển ở môi trường có nồng độ đường ban đầu cao (15 - 20% w/v), nếu không đủ lượng đường cho vi sinh vật sử dụng thì khả n ng tổng hợp acid citric kém, ngoài ra nguyên liệu phải 7 không lẫn nhiều tạp, chất kim loại nặng đặc biệt là sắt nếu hàm lương sắt quá giới hạn thì cần phải loại bỏ. 3.5.3. Mô ường nh ưỡng Nấm mốc cần đường, tinh bột và các muối vô cơ. Trong điều kiện thường nấm mốc chỉ phát triển sinh khối tạo ra rất ít a it citric. Trong trường hợp môi trường nhiều cabon và ít nitơ lượng đường 4 - 20%, nitơ 0,0 %, ngoài ra c n bổ sung thêm nguyên tố khoáng như P, Fe, Zn… thì quá trình tổng hợp axit citric xảy ra mạnh. 3.5.4. pH mô ường pH thích hợp để tạo thành a it citric từ 3 - 4, tùy thuộc vào chủng nấm mốc sử dụng. Ta có thể a it hoá môi trường bằng HCl, pH môi trường phụ thuộc vào nguồn nitơ. Nếu sử dụng NH4NO3 thì pH thích hợp là 3, nếu sử dụng NH4Cl thì pH thích hợp là 4. Trong quá trình lên men do sự tạo thành a it citric nên pH giảm mạnh, vì vậy cần phải điều chỉnh pH của môi trường cho thích hợp. 3.5.5. Sự hoáng khí Quá trình o i hoá cần một lượng lớn o y, vì vậy cần phải cung cấp không khí cho quá trình lên men bằng cách thông thoáng khí môi trường. Ngoài ra sự thông thoáng khí c n giảm lượng khí cacbonic trong môi trường. 3.6. Các yếu tố quyế định đến q á ình ản xuất acid citric 3.6.1. Mô ường hức n Bao gồm đường, các hợp chất hữu cơ, vô cơ. Để nuôi cấy Aspergillus niger sử dụng môi trường có thành phần g l : accaroza - 140; NH4NO3 - 2,23; KH2PO4 - 1; MgSO4.7H2O - 0,23. 3.6.2. Mô ường lên men Nước 1000 ml đường 150 g NH4Cl 1,9 g và bổ sung Zn O4 làm t ng khả n ng tích lũy acid citric. pH của môi trường:  Để nấm mốc phát triển tốt giữ pH 6.  Để lên men tốt giữ pH 3,4 - 3,5.  Để điều chỉnh pH thường dùng HCl. ì điều kiện môi trường để nấm phát triển và để thu acid citric là khác nhau nên trong sản uất phải chu n bị môi trường cho nấm phát triển đầy đủ, sau đó điều chỉnh môi trường thích hợp để lên men citric. 3.6.3. Sự hoáng khí Tất cả mi en của nấm mốc là loại hiếu khí điê n hình, rất cần o y tự do. Trong sản uất có thể thực hiện được bằng quạt gió vô trùng vào ph ng lên men hoặc thổi khí vô trùng vào dịch lên men. 8 3.6.4. nh hưởng của nh ệ độ Nhiệt độ thích hợp khoảng 31 - 370C. inh khối nấm mốc phát triển mạnh ở 34 - 37 0C. Để tạo ra nhiều acid cần duy trì nhiệt độ 31 - 320C. Nhiệt độ thấp hơn thì tích lũy nhiều acid gluconic. Nhiệt độ cao hơn thì việc tạo acid citric bị kìm h m. Thời gian nuôi cấy từ đến 10 ngày. Trong thực tế sản xuất người ta thường thổi không khí vô trùng vào dịch lên men. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men tạo a it citric là 31 – 370C. Thấp hơn thì tạo a it gluconic, cao hơn thì việc tạo axit citric bị kìm h m. Thời gian lên men khoảng 7 – 10 ngày. 3.6.5. Thờ g an lên men Thời gian tối ưu để quá trình sản xuất a it citric đạt tối đa phụ thuộc vào chủng được sử dụng, thành phần hóa học của môi trường, hệ thống lên men, và nói chung, các điều kiện theo đó quá trình lên men diễn ra. Trong quá trình lên men bề mặt, thời gian lên men thường được hoàn thành trong 10-20 ngày, trong khi ở quá trình lên men chìm thời gian ủ ngắn hơn nhiều khoảng từ (5- 10 ngày . Trong quá trình lên men trạng thái rắn thời gian lên men phụ thuộc mạnh mẽ vào chất tiêm chủng được sử dụng, độ m bề mặt, độ pH ban đầu, nhiệt độ và lượng mẫu trong môi trường ví dụ, vỏ hạt carob hoặc sung). Trong trường hợp này, nồng độ tối đa acid citric đạt được từ trong khoảng 10 đến 15 ngày. 9 Chương Công nghệ ản ấ acid citric ản uất acid citric có thể thực hiện theo phương pháp bề mặt hoặc cấy ch