Thảo luận Các phương pháp xác định vi sinh vật trực tiếp bằng buồng đếm và gián tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 03/06/2014 VSV-N4 ‹#› ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRỰC TIẾP BẰNG BUỒNG ĐẾM VÀ GIÁN TIẾP BẰNG CÁCH ĐẾM KHUẨN LẠC BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM Khoa: CNSH & KTMT MÔN: VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG GVHD:Nguyễn Duy Thanh NHÓM: 4 03/06/2014 1 MỤC LỤC 03/06/2014 VSV-N4 2 Mở đầu 03/06/2014 VSV-N4 3 Trong bất kỳ một loại mẫu vật nào, muốn biết số lượng chung của các nhóm vi sinh vật cũng như số lượng riêng của mỗi nhóm thành phần, đều cần phải đếm số lượng tế bào của chúng. Để xác định số lượng vi sinh vật trong đất, nước, không khí và dịch nuôi cấy … người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. 03/06/2014 VSV-N4 4 Trong đó có 2 phương pháp dưới đây được dùng nhiều hơn cả: Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng phiến kính có khung đếm Goriaep (phòng đếm hồng cầu). Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch. Mở đầu Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm 03/06/2014 VSV-N4 5 Cơ sở lý thuyết 03/06/2014 VSV-N4 6 Phương pháp đếm trực tiếp cho phép ta đếm số lượng vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, tảo Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, nhờ buồng đếm hồng cầu Buồng đếm Hemocytometer 03/06/2014 VSV-N4 7 03/06/2014 VSV-N4 8 Cấu tạo của buồng đếm 03/06/2014 VSV-N4 9 Nguyên tắc cấu tạo của buồng đếm: Là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông . Mỗi ô vuông lại được chia ra thành 16 ô vuông nhỏ , mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay 1/4000.000 ml. Buồng đếm có 1 lá kính dày để đậy. Cách tiến hành 03/06/2014 VSV-N4 10 Chuyển thể tích mẫu Để mẫu vào buồng đếm Đếm số lượng vi sinh vật Kết quả đếm được tế bào/ml. 03/06/2014 VSV-N4 11 Sau khi cho lên kính hiển vi 03/06/2014 VSV-N4 12 Cách đếm số lượng vi sinh vật 03/06/2014 VSV-N4 13 03/06/2014 VSV-N4 14 Cách đếm số tế bào trong mỗi ô lớn như sau: mỗi ô nhỏ có 4 cạnh giới hạn, đếm số lượng tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều. ví dụ: đếm cạnh bên dưới và cạnh bên phải. Đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều. Cứ đếm như vậy cho đến ô cuối cùng của 16 ô con. Cách tính toán Gọi A là số lượng tế bào đếm được trong 80 ô nhỏ Số lượng tế bào trong 1mm3 được tính theo công thức sau: số tế bào trong 1mm3 Trong đó: 4000 = 400*10 (1/400 mm2 : diện tích một ô nhỏ ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm tới lammelle) APL : độ pha loãng 03/06/2014 VSV-N4 15 Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm : quá trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vsv chứa trong mẫu. Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu. khó đạt được độ chính xác cao. Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. 03/06/2014 VSV-N4 16 Phương pháp đếm khuẩn lạc 03/06/2014 17 03/06/2014 VSV-N4 18 Ưu điểm: Cho phép xác định số tế bào sống Định lượng chọn lọc vsv Phương pháp: Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu Cấy mẫu vàomôi trường, ủ mẫu Đếm số khuẩn lạc hình thành Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu 03/06/2014 VSV-N4 19   pha loãngmẫu lỏng theo dãy thập phân Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc 03/06/2014 VSV-N4 20 Máy đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn Lạc tự động Đếm khuẩn lạc 03/06/2014 VSV-N4 21 Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 –300 Dùng bút để đếm các khuẩn lạc đã đếm Tính toán kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vsv trong dung dịch ban đầu) Khuẩn lạc vsvmọc trênmàng 03/06/2014 VSV-N4 22 E. coli trên môi trường ID Coli agar Coliforms trên môi trường ID Coli agar 1A 1B 2A 2B 2D 2C 1D 1C Phương pháp hộp trải: 0.1 ml dung dịch mẫu Trên mặt môi trường của hộp petri Dùng que gạt đều Ủ ở điều kiện thích hợp Đếm số khuẩn lạc : đơn vị CFU 03/06/2014 VSV-N4 23 Phương pháp hộp trải 03/06/2014 VSV-N4 24 Ưu điểm Định lượng được các VSV nhạy nhiệt Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu Nhược điểm Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp Phương pháp hộp đổ 03/06/2014 VSV-N4 25 Chuẩn bị đĩa petri vô trùng Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp) Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều Để nguội môi trường Đem ủ Đếm số khuẩn lạc Phương pháp hộp đổ 03/06/2014 VSV-N4 26 Ưu điểm Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml) Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150-300 khuẩn lạc Nhược điểm Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định Khó làm thuầnmột dòng VSV 03/06/2014 VSV-N4 27