Thu nhận và tinh chế enzyme

Trường ĐH Nông Lâm Tp HCM Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH CHỦ ĐỀ: GVHD: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: BÙI THỊ HỒNG GẤM MSSV: 06126031 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 1 MỤC LỤC Y Z I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME ......................................................2 1. Định nghĩa .............................................................................................2 2. Tính chất của enzyme ............................................................................2 II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ ............................................3 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế enzyme .....................................3 2. Thu nhận enzyme thô .............................................................................5 III. TINH SẠCH ENZYME .........................................................................6 1. Các phương pháp tủa protein/enzyme.....................................................6 2. Sự thẩm tách ..........................................................................................8 3. Sắc ký ...................................................................................................8 4. Phương pháp dùng chất hấp phụ ............................................................14 IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM ..........................................................15 V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME ...................................15 1.Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan ................................................15 2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel .....................................16 3. Phương pháp siêu ly tâm ........................................................................17 4. Kỹ thuật khối phổ ..................................................................................18 VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME ........................................................18 VII. TỔNG KẾT ...........................................................................................19 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Ðó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm...Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men. Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trò qua trọng của enzyme trong chuyển hoá các chất trong quá trình lên men. Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp, hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, glucoseoxydase, cellulase, lipase…Các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Đến nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới với sự kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu cũng như thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng những phân tử enzyme ưu việt hơn dạng tự nhiên. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, quá trình thu nhận và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trò cực kỳ quan trọng và không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người. TÓM TẮT Enzyme bản chất là protein được thu nhận từ ba nguồn: động vật , thực vật, vi sinh vật. Do đó rất đa dạng về cấu trúc, tính chất, chức năng…Nên việc thu nhận và tinh chế enzyme khá phức tạp vì quá trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất của từng loại enzyme mục tiêu, và phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau tùy từng loại enzyme. Tuy vậy, các quá trình tinh sạch enzyme vẫn ứng dụng các phương pháp cơ bản sau: thu dịch chiết (cơ học, lý , hoá), tủa ( bằng muối, dung môi hữu cơ, điểm đẳng điện), thẩm tách, từng bước tinh sạch bằng sắc ký ( sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp), kết tinh chế phẩm, đánh giá kết quả tinh sạch và kiểm tra hoạt tính enzyme: xây dựng đường biểu diễn về độ hoà tan, điện di (điện di một chiều, điện di dựa vào điểm đẳng điện, điện di hai chiều, điện di mao dẫn), siêu ly tâm, khối phổ, I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 1. Định nghĩa Enzyme (E) là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. E có tất cả trong tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. (CNSH Enzyme và Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã). Trong phản ứng E xúc tác các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), E sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. E có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác. E không chỉ có thể xúc tác các phản ứng trong cơ thể sống , mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều kiện nhất định.Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym [1]. E có tính đặc hiệu cao, nghĩa là mỗi E chỉ tác dụng trên một hay một số S (cơ chất ) nhất định ở nhiệt độ và áp suất bình thường. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 3 2. Tính chất của enzyme 1. Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số E có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn. 2. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. 3. Không bền dưới tác dụng của nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm E mất khả năng hoạt động. 4. Enzym có tính lưỡng tính: Tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện. 5. Enzym chia làm hai nhóm: E một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase... và các E hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein). ™ Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần: • Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu. • Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp.. II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế E Như đã nói ở trên, E là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi rất không bền, có thể dễ bị biến tính (denaturation) và bị mất hoạt độ. Do đó, khi làm việc với E phải chú ý tránh làm mất hoạt tính của nó. Thông thường phần lớn E hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7+ 2). Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh đều dễ gây biến tính E. Nhiệt độ cao và các chất oxy hoá và chất khử, …cũng là một trong số những nguyên nhân gây biến tính E. Tuy nhiên các E khác nhau có thể nhạy cảm với những tác nhân gây biến tính khác nhau. Vì thế, khi tách và tinh sạch E cần tiến hành ở nhiệt độ thấp từ 0oC đến 5oC. Đối với các E không bền quá trình tinh sạch được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn từ -5oC đến -20oC. Trong trường hợp này người ta sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc… Bảng 1: Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3oC Nước đá : H2SO4 đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0 oC Tiến hành tinh sạch ở nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E cũng như tác dụng phân giải của các E proteolytic có mặt trong dịch chiết. Đối với nhiều E có thể bổ sung chất ức chế của E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thủy phân đối với E quan tâm. Các E [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 4 proteolytic được phân thành 4 lớp: protease serin, protease cystein, protease acid, protease chứa kim loại. Trên cơ sở 4 lớp của protease này, người ta cũng chia chất ức chế của E này thành 4 lớp tương ứng. chất ức chế hai E protease serine và protease cystein được sử dụng nhiều do sự phổ biến của hai E này. Đối với một số E nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4 loại chất ức chế đều được sử dụng. Bảng 2: Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng trong tách chiết, tinh sạch protein/E Chất ức chế Nồng độ và thời gian hiệu quả Dung môi pha dung dịch gốc và nồng độ chất ức chế Điều kiện và thời gian bảo quản ở dạng dung dịch gốc E proteolytic bị ức chế Phenyle methyl sulphonyl fluoride (PMSF) 0,1-1mM vài giờ 100mM trong ethanol hoặc isopropanol 2-3 tháng ở nhiệt độ phòng Protease serine Leupeptin 10-100μM 10mM trong H2O 1 tuần ở 4oC hoặc 1 tháng ở -20oC Protease kiểu trypsin và một số kiểu protease cystein Iodoacetic acid hay iodoacetate (IAA) 10-100μM vài giờ 100mM trong H2O Chỉ chuẩn bị trước khi dùng Protease cystein Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) 1-2mM, lâu dài 500mM pH 8,0 6-12 tháng ở nhiệt độ phòng Protease chứa kim loại (trừ loại chứa Ca2+ thì phải dùng EGTA) Pepstain A 1μM vài giờ 1mM trong tanol 3-4 tháng ở -20oC Một số protease acid Bổ sung các yếu tố làm bền (như CaCl2 hay MgCl2 với nồng độ 2-5mM, glycerol 10- 20%...), chất chống oxy hoá (β-mercaptoethanol hay dithiothreitol 1-5mM…). Xây dựng quy trình đơn giản cũng là cách để bảo toàn hoạt tính E. Đối với một số E bền nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt (70-80oC, trong vòng 15-30 phút) và xử lý acid (pH 3-4) đối với các E bền acid nhằm hạn chế tác dụng phân cắt của proteolytic, vừa loại bỏ một số protein không mong muốn. Tránh tạo bọt khí vì nhiều E sẽ biến tính ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Để tránh bọt khí. Chỉ sử dụng các gụng cụ inox để cắt xay nguyên liệu để tránh tác dụng của kim loại nặng làm mất hoạt tính E. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 5 2. Thu nhận enzyme a . Chọn nguồn nguyên liệu Việc điều chế chúng bằng phương pháp hoá học rất khó khăn và tốn kém, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn nguyên liệu sinh học. Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học: ™ Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, và một số E khác. Ví dụ: Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đông sữa trong sản xuất fomat. ™ Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hoá chất ấy. Ví dụ: hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu nành có nhiều E urease, papain thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép của thân và lá cây Ficus… Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật thì không thể sản xuất chế phẩm E với quy công nghiệp bởi các nhược điểm: - Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài - Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được - Đây là nguồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm không thể dùng để sản xuất sản phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực. ™ Vi sinh vật: Là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất E có nhiều ưu điểm nổi bật, là nguồn nguyên liệu vô tận, có thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (16-100 giờ). Hệ E vi sinh vật vô cùng phong phú. Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ. E vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá một lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng. b. Thu dịch chiết E thô Các E nội bào không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu trúc tế bào chứa chúng. Do đó, để chiết rút E nội bào thì điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa E và chuyển chúng và dung dịch. Biện pháp cơ học như nghiền tế bào với cát thuỷ tinh hay cát thạch anh, làm đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá (homogenizator). Đối với mô thực vật thì ta thường thái nhỏ mẫu hoặc cho trương nước để tăng hiệu quả phá vỡ tế bào. Còn ở mô động vật khi chiết E người ta cần cắt bỏ mô liên kết. Đối với các E trong cấu tử ( nhân, microsome, ty thể, lyosome…) tế bào, để thu nhận dịch chiết E ta có thể dùng các yếu tố vật lý và hoá học khác như sóng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt, dùng E (lyoyme, mutanolizin), dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate…), chất detergent. Các chất này có tác dụng tốt trong phá vỡ cấu tử tế bào do trong các bào quan này thường có chứa nhiều mỡ. Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, E được chiết bằng nước cất, dung dịch đệm hoặc muối trung tính. * Một số lưu ý khi chiết rút E + Chiết rút và kết tủa E ở nhiệt độ thấp ( 3 - 5oC ) [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 6 + Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly được thêm vào để tăng hiệu quả chiết rút E như NaCl, ZnCl2, CaCl2… * Lưu ý: Các nguyên liệu động vật, thực vật thường có mặt những chất có màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch và xác định hoạt lực của E, nên ta thêm vào chất khử để loại màu. Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, hoặc bổ sung các tác nhân gây kết tủa protein/E để loại một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan E trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp. III. TINH SẠCH ENZYME Thu nhận E dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Hỗn hợp chứa E sẽ phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc tính nhất định để thu được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến hành xác định hoạt tính và nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa, màng bán dẫn, sắc ký. 1. Các phương pháp tủa protein enzyme Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đó tủa bằng muối được sử dụng nhiều nhất. a. Tủa bằng muối Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ nhất định. Lượng muối có thể được loại bỏ thông qua bước thẩm tách. Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn: log S = B - KI Trong đó S: độ hòa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Hình1. Độ tan theo nồng độ muối ( Khả năng tủa protein phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein/E của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 7 Để tủa E từ dịch chiết thô ta có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese (NH4)2SO4, do nó có độ hoà tan rất cao trong nước (720g/l,nhiệt độ 25oC), ít làm mất tác dụng E thậm chí còn có tác dụng làm bền E. Ngoài ra ammonium sulfatese có khả năng tủa chọn lọc protein, do đó giúp loại một số protein không mong muốn ra khỏi dịch chiết. Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa + Dạng bột: Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. 0,515 x V (S2-S1) X(g) = 1-0,272S2 + Dịch bão hòa: Cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết E thì độ (NH4)2 SO4 không tăng dột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca ++ làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2). Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm tích thường là 24 - 28h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt. Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ E. Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các E có trọng lượng phân tử lớn xuống trước. Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2 SO4 bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung dịch muối này. Ðiều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác. 100 ( S1-S2 ) V (ml) = 1-S2 * Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfatese + Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng nhanh cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt tính E. + Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa. b. Tủa bằng các dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, trừ một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) và ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao. Ethanol hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa có thể có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80% (v/v) trở lên). Sau X: khối lượng (NH4)2SO4 S1: độ bão hoà cho trước S2: độ bão hoà cần thiết V: thể tích (NH4)2SO4 S1: độ bão hoà cho trước S2: độ bão hoà cần thiết [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 8 đó dung môi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không hay thậm chí trong không khí. Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0oC và có thể đến – 20 oC, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein E. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng tách dùng máy ly tâm. Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm là hay có màu. Ví dụ: Hình 2: Mức tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease có trong dịch trích từ ruột cá Basa khi sử dụng các tác nhân kết tủa khác nhau (Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti)-TrầnQuốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM) c. Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi pH của môi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. + pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). + pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). + Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó