Tiểu luận Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 1 TIỂU LUẬN Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro ---------- o 0 o ---------- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 2 Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro ---------- o 0 o ---------- Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bao gồm: + Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành + Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. + Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành + Nuôi cấy mô sẹo (callus) + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (in vivo). Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp. *Cơ sở khoa học Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá. - Tính toàn năng của tế bào: Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 3 năng của tế bào. Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá. - Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào + Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt. + Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó. Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được biểu diễn theo sơ đồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. *Các ứng dụng Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 4 tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Ứng dụng: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại cây trống khác nhau. + Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt + Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa các loại cây trồng khác. + Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus + Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn. Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất. *Các bước trong nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975) Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975) Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 5 tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) Bước 3: nhân nhanh Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối… Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: - Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) - Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi… Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 6 - Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp. * Các phương pháp nhân giống in vitro Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau: * Ưu điểm - Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm. - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài - Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36-1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn. - Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh của thời vụ. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 7 - Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro * Nhược điểm - Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn - Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bi mất cân bằng nước, gây hiện tượng cây bị héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh. - Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao. - Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống + Tính bất định về mặt di truyền + Sự nhiễm mẫu + Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy + Hiện tượng thuỷ tinh hoá Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 8 Chuyên đề 4: Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus? Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh? ------------- o 0 o ------------- * Tác hại của virus: Trong thế giới các loài sinh vật thì thế giới của các loài vi sinh vật vô cùng đa dạng và phức tạp mà đến nay vẫn còn rất nhiều loài mà con người vẫn chưa biết đến. Người ta thường phân vi sinh vật thành 2 loại là vi sinh vật có tác dụng tốt cho con người và vi sinh vật có hại cho con người. Trong thế giới vi sinh vật ấy thì virus là một loại rất nguy hiểm. Đối với cả con người và các loài động thực vật khác khi đã nhiễm bệnh virus thì không có một loại thuốc nào có thể chữa được, mà chỉ phụ thuộc vào khả năng đề kháng của cơ thể. Vì vậy, để đề phòng và chống lại tác hại của virus người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động thực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan tâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp. Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến, trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.), qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.). Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm chất của nông sản. Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus truyền bệnh Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 9 * Cơ sở lý luận của phương pháp: Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950), Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới. Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh. Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây (trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm). Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở khẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau: - Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô phân sinh đỉnh. - Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus. - Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác trong cây. - Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép virus. * Kỹ thuật làm sạch virus in vitro: - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước <0,3mm, nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khác nhau để thu nhận cây sạch bệnh. - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao: ở nhiệt độ cao 36-370C thì một số loài virus không còn khả năng nhân lên. Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với xử lý nhiệt để tẩy sạch virus khỏi mẫu. Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5- Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 10 1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0,1-0,2mm. Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-370C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô phân sinh đỉnh (5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39-400C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao. - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus. - Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với cây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh. Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:  Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra các giống khoai tây sạch bệnh virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến. Để nhân giống in vitro khoai tây cần thực hiện các bước sau đây: + Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi cấy 8-10 cây trong bình 250ml. + Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml. + Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 20-220C. + Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp 11 Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ  Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau: + Bước 1: Khử trùng mẫu. Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường. Nụ hoa được lấy về sau đó khử trùng bằng HgCl 2 nồng độ 0,1% trong 7 phút. + Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng. Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiền chồi bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki, 0,2pp IAA). + Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm. Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppm Ki). + Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh. Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môi trường nhân tạo (MS, 0,1ppm α-NAA). + Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi. Cây con được trồng trong giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhất cho cây con phát triển. Sau đó cây con được đưa ra vườn sản xuất. Tiến hành chăm sóc bình thường. Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc