Tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NGUYỄN THỊ KIM HIỀN TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. NGUYỄN LÊ TRANG NGUYỄN THỊ KIM HIỀN TS. NGUYỄN NGỌC HẢI KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  PURIFICATION OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. NGUYEN LE TRANG NGUYEN THI KIM HIEN Dr.NGUYEN NGOC HAI TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Con xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Lê Trang - ngƣời thầy đã dạy dỗ, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tại Viện Pasteur. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Nguyệt Thu, KS Đỗ Thị Châm, KS Võ Thị Mỹ Duyên, CN Lạc Ngọc Thêm, CN Lại Ngọc Diễm, chị Sim phòng Miễn Dịch, Viện Pasteur đã nhiệt tình giúp đỡ, dạy bảo em nhiều điều trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Pasteur – TpHCM đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại Viện. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Kim Hiền ii TÓM TẮT NGUYỄN THỊ KIM HIỀN, Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 7/2006. “TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B”. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN LÊ TRANG. TS.NGUYỄN NGỌC HẢI. Việt Nam là một trong những nƣớc có nguy cơ cao về nhiễm virus viêm gan Baïn, với tỷ lệ ngƣời mang HBsAg trong cộng đồng dân chúng từ 15 – 26%. Do đó, nguồn kháng nguyên tự nhiên ở những ngƣời bệnh mang HBsAg là rất nhiều. Đồng thời, HBsAg là kháng nguyên đƣợc sản xuất ra gấp bội so với các loại kháng nguyên khác . Mặc khác HBsAg lại rất đặc hiệu để chẩn đoán bệnh viêm gan B .Vì vậy, chúng tôi tiến hành tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B để phục vụ cho nhu cầu sản xuất kháng thể để tạo các bộ sinh phẩm chuẩn đoán cũng nhƣ dùng làm vaccine phòng bệnh. Sau khi tiến hành đề tài, chúng tôi đã đạt đƣợc những kết quả sau:  HBsAg đƣợc tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lƣợng protein tổng số là 32,35.103 mUI/ OD.  Độ tinh khiết của sản phẩm là 44 lần.  HBsAg đƣợc tinh chế khá tốt, kết quả đƣợc thể hiện trên gel điện di: dung dịch HBsAg thu đƣợc có chứa các băng có trọng lƣợng phân tử từ 25 – 28 kDa tƣơng ứng với các quyết định kháng nguyên của HBsAg. Đề tài này là một bƣớc quan trọng để tiến hành tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán phát hiện virus viêm gan B trong máu. iii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ........................................................................................................... i Tóm tắt ............................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................ iv Danh sách các hình ........................................................................................... v Danh sách các bảng .......................................................................................... vi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................... 1 1.2 Mục đích – Yêu cầu ........................................................................ 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN ................................................................................ 3 2.1 Lịch sử phát hiện của HBV ............................................................ 3 2.2 Phân loại HBV ................................................................................ 3 2.3 Hình dạng - Cấu trúc HBV ............................................................. 3 2.3.1 Hình dạng HBV ..................................................................... 3 2.3.2 Cấu trúc gen HBV .................................................................. 5 2.4 Quá trình sao chép và nhân lên của HBV ...................................... 8 2.5 Phƣơng pháp xét nghiệm để phát hiện HBV ................................ 10 2.5.1 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học ............................ 10 2.5.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa trên chức năng gan ................ 10 2.5.3 Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học và hoá miễn dịch. 10 2.6 Các kiểu lây truyền HBV ............................................................. 12 2.7 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) ....................... 12 2.7.1 Bản chất HBsAg .................................................................. 12 2.7.2 Tầm quan trọng HBsAg ....................................................... 12 2.7.3 Các phân typ HBsAg ........................................................... 13 2.7.4 Tinh khiết HBsAg ................................................................ 14 2.7.5 Định lƣợng HBsAg ............................................................. 14 iv PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................... 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ...................................................................... 15 3.2.1 Dụng cụ ................................................................................ 15 3.2.2 Thiết bị ................................................................................. 15 3.2.3 Hoá chất và cách chuẩn bị các dung dịch ............................ 15 3.2.3.1 Hoá chất .................................................................... 15 3.2.3.2 Cách chuẩn bị các dung dịch .................................... 16 3.3 Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 20 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................. 21 3.4.1 Phƣơng pháp tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ......... 21 3.4.1.1 Nguyên tắc ................................................................ 21 3.4.1.2 Tiến hành .................................................................. 23 3.4.2 Phƣơng pháp tinh chế protein bằng hệ thống gel lọc - cột Sephacryl 300 .............................................................. 23 3.4.2.1 Nguyên tắc ................................................................ 23 3.4.2.2 Tiến hành .................................................................. 24 3.4.3 Phƣơng pháp tinh chế protein bằng sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate ............................ 25 3.4.3.1 Nguyên tắc ................................................................ 25 3.4.3.2 Tiến hành .................................................................. 26 3.4.4 Phƣơng pháp định lƣợng protein bằng đo mật độ quang – OD 280nm ......................................................................... 26 3.4.4.1 Nguyên tắc ................................................................ 26 3.4.4.2 Tiến hành .................................................................. 26 3.4.5 Phƣơng pháp điện di trên SDS - polyacrylamide gel kiểm tra mức độ tinh chế ..................................................... 26 3.4.5.1 Nguyên tắc ................................................................ 26 3.4.5.2 Tiến hành .................................................................. 28 v 3.4.6 Phƣơng pháp định lƣợng HBsAg ......................................... 28 3.4.6.1 Khái niệm ................................................................. 28 3.4.6.2 Nguyên tắc hoạt động ............................................... 28 3.4.6.3 Mục đích ................................................................... 29 3.4.6.4 Xác định kết quả ....................................................... 29 3.4.6.5 Đánh giá kết quả thí nghiệm ..................................... 29 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 30 4.1 Kết quả định lƣợng kháng nguyên HBsAg trong huyết thanh ...... 30 4.2 Kết quả ở giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ...... 30 4.3 Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel - cột Sephacryl S300 ..................................................................... 32 4.4 Kết quả tinh chế HBsAg bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate .................................... 34 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 38 5.1 Kết luận ........................................................................................ 38 5.2 Đề nghị ......................................................................................... 38 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................... 39 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮC HBV Hepatitis B Virus HBsAg Hepatitis B surface Antigen HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B e Antigen kb kilo base kDa kilo Dalton p protein gp glycoprotein DNA Desoxyribose Nucleic Acid RNA Ribose Nucleic Acid TB tế bào KN kháng nguyên ALT Alanine Aminotransfease, SGPT SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel PEG Polyethylene Glycol DTT Dithiothretol APS Ammonium persulfate TEMED Tetra – methylenediamine OD Optical Density MW Molecular Weight IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M PCR Polymerase Chain Reaction vii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Các dạng HBV. .................................................................................. 4 Hình 2.2. Tổ chức genome của HBV ................................................................ 5 Hình 2.3. Mô hình Virus toàn vẹn (virion) ....................................................... 6 Hình 2.4. Lƣợc đồ vòng đời HBV ..................................................................... 8 Hình 2. 5. Quá trình sao chép và nhân lên của HBV. ....................................... 9 Hinh 3.1. Quá trình thẩm tích .......................................................................... 22 Hình 3.2. Sắc ký lọc gel ................................................................................... 24 Hình 3.3. Sắc ký ái lực .................................................................................... 25 Hình 3.4. Nguyên tắc hoạt động của kit Architect®HBsAg (Abbott) ........... 28 Hình 4.1. Kết quả điện di SDS – PAGE 5 -15 % sau khi tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hoà .................................................... 30 Hình 4.2. Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy AKTA với cột Sepharyl S 300 ................................................................................. 32 Hinh 4.3. Kết quả điện di SDS – PAGE 5- 15 % sau khi qua cột Sepharyl S 300 ................................................................................. 33 Hình 4.4. Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy AKTA với cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate ................................................................... 35 Hình 4.5. Kết quả điện di 15% SDS - PAGE DTT sau khi qua cột S Sepharose CL – 4B Dextran sulfate ................................................................. 36 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Ý nghĩa các dấu ấn huyết thanh học của HBV ở bệnh nhân viêm gan B .................................................................................... 11 Bảng 2.2. Các dấu ấn HBV chính trong viêm gan B cấp và mạn ................. 11 Bảng 2.3. Phân typ của HBsAg ..................................................................... 13 Bảng 4.1. Kết quả sau quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate ..... 31 Bảng 4.2. Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên Sepharyl S 300 ............................................................................. 33 Bảng 4.3. Kết quả thu đƣợc sau toàn bộ quá trình tinh chế HBsAg ............. 37 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh viêm gan virus B (HBV) là vấn đề mang tính toàn cầu, bởi đây là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Virus viêm gan B cũng chính là tác nhân liên quan đến ung thƣ tế bào gan và một số bệnh liên quan đến xơ gan, viêm gan mạn tính. Ngoài ra, HBV còn có thể lây truyền cho ngƣời khác qua đƣờng máu (tiếp xúc với máu hay các sản phẩm từ máu, dụng cụ dính máu). Theo ƣớc tính, ngƣời mang HBsAg sẽ có 40% có nguy cơ ung thƣ gan, tuy vậy có thể ngăn ngừa bệnh bằng vaccine, đặc biệt là lúc mới sinh bệnh. Theo phân bố dịch tễ học HBV của Tổ chức y tế Thế giới thì Việt Nam là một trong những nƣớc có nguy cơ cao về nhiễm virus viêm gan B, với tỉ lệ ngƣời mang HBsAg trong cộng đồng dân chúng từ 15 - 26%. Do đó, nguồn kháng nguyên tự nhiên ở những ngƣời lành mang HBsAg là rất nhiều. Đồng thời, HBsAg là kháng nguyên đƣợc sản xuất ra gấp bội so với các loại kháng nguyên khác của HBV và có hoạt tính kháng nguyên cao có thể sản sinh đƣợc kháng thể bảo vệ và chống lại HBV. Mặt khác, HBsAg lại rất đặc hiệu để chuẩn đoán bệnh HBV. Vì vậy, y học đã sử dụng HBsAg để làm vaccine, cũng nhƣ làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể nhằm tạo các bộ sinh phẩm chuẩn đoán HBV. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tinh chế kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B”. 2 1.2. Mục đích Tinh chế HBsAg tinh khiết từ dung dịch huyết thanh có HBsAg (+ + +) cao, xác định những ƣu điểm trong quy trình để đạt độ tinh khiết cao nhất có thể. 1.3. Yêu cầu  Loại bỏ lần lƣợt các thành phần protein huyết thanh qua các quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate, sắc ký lọc trên gel Saphacryl S300, sắc ký ái lực trên Sepharose CL - 4B - dextran sulfate.  Xác định tổng lƣợng protein bằng phƣơng pháp đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 280 nm (OD 280nm).  Xác định hàm lƣợng kháng nguyên HBsAg bằng phƣơng pháp định lƣợng miễn dịch.  Kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên HBsAg đã tách chiết bằng phƣơng pháp điện di trên SDS - PAGE. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN 2.1. Lịch sử phát hiện HBV  1963: Blumberg phát hiện một loại kháng thể có thể phản ứng với một loại kháng nguyên trong mẫu huyết thanh của một thổ dân Úc bị viêm gan. Và đƣợc gọi là kháng nguyên Úc Châu (Au).  1967: phát hiện Au, là kháng nguyên bề mặt của virus gây viêm gan siêu vi loại B (HBsAg).  1970: Dane phát hiện kháng nguyên lõi (HBcAg), có đƣờng kính 42 nm trong máu của bệnh nhân bị viêm gan siêu vi B - gọi là hạt tử Dane.  1973: phát hiện HBeAg (kháng nguyên nội sinh).  1979: nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần.  1983: khuếch đại DNA virus bằng phƣơng pháp PCR do Mullis phát hiện. 2.2. Phân loại HBV Hepatitis B virus (HBV) thuộc họ Hepadnaviridae do tính hƣớng gan và bộ gen DNA kép của chúng. Họ Hepadnaviridae có 2 nhóm phụ:  Orthohepadnavirus: gây viêm gan B ở loài có vú.  Avihepadnavirus: gây viêm gan B ở loài chim. 2.3. Hình dạng - Cấu trúc HBV [ 2 ] [ 3 ] [ 18 ] 2.3.1. Hình dạng Khi quan sát huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân lên của siêu vi bằng kính hiển vi điện tử, ngƣời ta thấy có 3 dạng khác nhau  Hạt tử Dane hoặc virion hoàn chỉnh  Có dạng hình cầu, đƣờng kính 42 nm.  Khi nhuộm âm bản, virion hiện rõ cấu trúc 2 vỏ  Vỏ bọc bên ngoài đƣợc tạo bởi các protein bề mặt (HBsAg)  Vỏ bên trong đƣợc cấu tạo từ các protein lõi (HBcAg), tạo thành hình cầu có đƣờng kính 28 - 34 nm; gồm khoảng 240 bản sao của protein lõi. Bên trong chứa 4 cấu trúc DNA chuỗi đôi và các enzyme nhƣ enzyme DNA polymerase và protein kinase.  Cấu trúc hình cầu  Có đƣờng kính 15 - 25 nm, thƣờng có nồng độ 1013 /ml.  Đƣợc cấu tạo từ các protein bề mặt.  Các cấu trúc hình ống  Có đƣờng kính 20 - 22 nm, có chiều dài thay đổi, có nồng độ 1011/ml.  Các cấu trúc này có thể do cấu trúc hình cầu chồng chất lên nhau tạo ra. Hai cấu trúc hình cầu và hình ống là phần kháng nguyên bề mặt của siêu vi đƣợc sản xuất dƣ thƣờng từ tế bào gan và chúng biểu hiện những đặc tính kháng nguyên HBsAg. Nồng độ HBsAg trong huyết thanh 10 - 1000 µg/ml. Hình 2.1. Các dạng HBV 5 2.3.2. Cấu trúc gen Bộ gen HBV toàn vẹn có chiều dài từ 3.182 - 3.221 base. Bộ gen ở dạng vòng, gồm 2 sợi DNA có chiều dài không bằng nhau.  DNA chuỗi âm: nằm bên ngoài, 3 - 3,3 kb (thay đổi tuỳ loài Hepadnavirus), mã hoá cho các thông tin di truyền, chứa nhiều gen chồng lấp lên nhau, tạo thành vòng tròn liên tục và dƣ ra một đoạn 8 - 9 nucleotide. Đầu 5’ của mạch DNA âm mang vị trí gắn kết DNA polymerase của virus.  DNA chuỗi dƣơng: nằm bên trong, 1,7 - 2,8 kb, có đầu tận cùng 5’ cố định nhƣng đầu 3’ thay đổi. Đa số các bộ gen HBV có một đoạn hổng mạch đơn có chiều dài 300 - 2000 base. Đầu 5’ của mạch DNA dƣơng đƣợc tạo bởi một oligoribonucleotide dài 18 base, đƣợc gắn chóp giống mRNA. Cấu trúc vòng của DNA đƣợc đảm bảo nhờ sự ghép nối hai đầu 5’ của hai sợi DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide gọi là vùng liên kết.Vùng này nằm giữa hai trình tự DR1 và DR2 có 10 - 11 nucleotide. DR1 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA âm và cũng hiện diện ở đoạn dƣ của đầu 3’. DR 2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA dƣơng. Hai trình tự này đóng vai trò khởi sự quá trình sao chép các chuỗi DNA tƣơng ứng. Hình 2.2. Tổ chức genome của HBV ( Trên mạch DNA âm của HBV của loài có vú có 4 khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein tƣơng ứng. Các đoạn đọc mở này nằm chồng lên nhau. Quá trình đọc mã bắt đầu bằng codon mở đầu (AUG) và kết thúc bằng codon kết thúc (TAG). 6  Gen S Bao gồm vùng S, pre –S1, pre-S2, mã hoá để tổng hợp các protein bề mặt.  Đoạn gen S: mã hoá cho protein bề mặt nhỏ (Small Hepatitis B surface) gồm 226 acid amine, có trọng lƣợng phân tử 24 kD. Protein này rất kỵ nƣớc, có thể glycosyl hoá ở asp 146. Là protein chủ yếu chiếm đa số. Ngƣời ta phát hiện ở vùng S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên. Tuỳ theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên mà ta phân loại đƣợc các chủng loại HBV. Quyết định chung ở tất cả các chủng phân lập HBs là a, kế đến là d và y, cuối cùng là w và r. Quyết định kháng nguyên w lại gồm những biến thể w1, w2, w3, w4. Hình 2.3. Mô hình virus toàn vẹn (virion) (  Nếu trình tự đọc mã bắt đầu từ vùng pre-S2 và tiếp tục cho đến hết vùng S sẽ tổng hợp nên protein bề mặt trung bình (Medium Hepatitis B surface) có trọng lƣợng phân tử 33 kD, gồm 281 acid amine rất ƣa nƣớc. Protein này gồm 2 dạng glycoprotein: gp 33 và gp 36. Vùng pre-S2 có đoạn trùng hợp với albumin huyết thanh (serium albumin) và trên tế bào gan có thụ quan đặc biệt cho albumin và thụ quan này là điểm xâm