Tinh chế protein tái tổ hợp gnrh - Tbk ở e Coli

TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP GNRH-TBK Ở E. COLIĐặng Thành Nam & Phan Văn ChiViện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG 1. ĐẶT VẤN ĐỀGnRH-TBK là một “độc tố miễn dịch” tái tổ hợp (Recombinant Immunotoxin-IT) được tạo ra nhờ sự kết hợp giữa thành phần hướng đích là hormon giải phóng kích dục tố (Gonadotropin Reseasing Hormon-GnRH) và thành phần độc tố là một protein bất hoạt ribosom lớp 1 Trichobakin[1, 2], nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các dòng tế bào bộc lộ GnRH receptor bề mặt đặc hiệu. TBK được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan, có hoạt tính N-glycosidase, có khả năng nhận biết và phân cắt đặc hiệu gốc adenin ở vị trí 4324 của ARN ribosom 28S dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein và gây chết tế bào [3, 4]. GnRH là một neurodecapeptid, có ái lực cao (Kd khoảng 10-9 M) với các GnRH receptor (GnRHR) và không gây đáp ứng miễn dịch. GnRHR đã được phát hiện thấy nhiều trên bề mặt tế bào thuộc các mô ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, tuyến tuỵ[5-9]. Hơn nữa GnRH cũng đã được sử dụng làm thành phần hướng đích trong một số độc tố miễn dịch tái tổ hợp như recombinant GnRH-PAP fusion toxin. Trong đó PAP là cũng là một protein bất hoạt ribosom được tách chiết từ cây Phytolacca americana. GnRH-PAP đã có khả năng ức chế đặc hiệu một số dòng tế bào ung thư có biểu hiện các GnRHR bề mặt[5].Tiếp nối những nghiên cứu về thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK ở E.coli [1], trong bài này chúng tôi giới thiệu về các điều kiện biểu hiện và kết quả tinh chế loại protein tái tổ hợp này. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Nguyên liệuVector biểu hiện pGnRH-TBK mang gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK được thiết kế tại Phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội [1]. Để nghiên cứu biểu hiện có sử dụng tế bào E. coli chủng BL21(DE3), môi trường Luria-Bertani(LB), isopropylthio-b-D-galactoside(IPTG), ampicillin và các hoá chất thông thường khác.2.2 Phương pháp nghiên cứu2.2.1 Điện di SDS-PAGEĐiện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) được tiến hành theo các phương pháp của Laemmli [12]. 2.2.2 Sắc kí trao đổi ion trên hệ FPLCSau khi biểu hiện, sinh khối tế bào được thu lại và phá bằng siêu âm trong đệm 50 mM Tris-HCL pH 7,0 có chứa 20 mM EDTA, Triton X-100 0,1%, lysozyme 100mg/ml. Huyền dich tế bào sau khi phá được ly tâm ở 12 000 vòng/phút trong 20 phút, để tách riêng phần cặn và nổi. Phần nổi được nạp thẳng vào cột CM- Sepharose(XK- 16/20). Protein mang điện tích trái dấu sẽ được giữ trên cột, còn các protein khác bị rửa trôi khỏi cột bằng đệm Tris-HCL pH 7,0. Cột được tiếp tục rửa cho đến khi A280 nm trở lại đường nền. Mẫu được thôi ra khỏi cột bằng gradien nồng độ 0,0-0,4 M NaCl nhờ chương trình phần mềm trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech).2.2.3 Western blotting và phân tích trình tự đầu N của protein tái tổ hợpCác phương pháp Western blotting và xác định trình tự các axit amin đầu N theo nguyên lý Edman được tiến hành như đã mô tả [13] 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của GnRH-TBKTế bào E. coli chủng BL21(DE3) chứa vector biểu hiện pGnRH-TBK đã được chứng minh có biểu hiện GnRH-TBK ổn định [1], tiếp tục được sử dụng làm đối tượng trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, GnRH-TBK là protein lạ đối với tế bào chủ (E .coli), nên GnRH-TBK được biểu hiện ra chủ yếu ở dạng không tan (inclusion bodies). Do vậy để có thể thu được GnRH-TBK ở dạng tan đồng thời xây dựng quy trình tinh sạch GnRH-TBK, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo thì việc xác định điều kiện biểu hiện thích hợp là hết sức cần thiết. Trong phạm vi nghiên cứu của mình, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự biểu hiện của GnRH-TBK ở dạng tan. Sự biểu hiện của GnRH-TBK được tiến hành khảo sát ở 22oC, 30oC và 37oC. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng trong các bình tam giác giống nhau, lắc 200 vòng/phút ở 37oC, cho đến khi A600 nm đạt 0.4-0.6. Cảm ứng bằng IPTG (nồng độ cuối 0.4 mM) và tiếp tục lắc 200 vòng/phút ở 22oC, 30oC và 37 oC. Sinh khối tế bào ở các thời điểm khác nhau 1, 2, 3, 4 giờ và qua đêm(16 giờ) được thu lại bằng ly tâm ở 5000 vòng/phút và phá bằng siêu âm trong đệm như đã mô tả ở trên. Huyền dịch tế bào sau khi phá được ly tâm ở 12000 vòng/phút, trong 20 phút để tách riêng các phần cặn và nổi. Protein tổng số thu được ở phần nổi và cặn được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. Từ kết quả thu được cho thấy, ở 22oC và sau16 giờ được cảm ứng protein GnRH-TBK được tạo ra tập trung chủ yếu ở dạng tan. Nhưng cùng thời gian trên ở 30oC và 37oC, protein GnRH-TBK lại được biểu hiện ra chủ yếu ở dạng không tan. 3.2 Tinh chế protein GnRH-TBK tái tổ hợpĐể phục vụ cho tinh chế và những nghiên cứu tiếp theo, quá trình biểu hiện protein GnRH-TBK được tiến hành ở 22oC qua đêm (16 giờ). Sinh khối các tế bào vi khuẩn BL21(DE3) được xử lý như đã mô tả ở phần phương pháp. Phần nổi sau ly tâm được nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia- Biotech). Các tạp chất được rửa bằng đệm 50 mM Tris-HCl pH 7, 0 cho đến khi A280 nm trở lại đường nền. Immunotoxin tái tổ hợp GnRH-TBK được thôi ra khỏi cột bằng gradien nồng độ 0,0-0,4 M NaCl trong đệm 50 mM Tris-HCl pH 7,0 với tốc độ dòng chảy 60 ml/giờ và kích thước mỗi phân đoạn là 1 ml. Hình 1: Tinh chế protein lai GnRH-TBK. A: Phổ sắc ký tinh chế GnRH-TBK qua cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech); B: Điện di SDS-PAGE các phân đoạn protein thu được; M: Thang protein chuẩn; 1 - 12: Các phân đoạn ở đỉnh phổ; WB: Western blot với huyết thanh thỏ kháng TBK Trên hình 1A là phổ sắc ký đặc hiệu cho mẫu thu được từ 500 ml dịch nuôi cấy. Trên phổ có một đỉnh hấp thụ duy nhất đặc trưng cho protein lai GnRH-TBK. Kiểm tra các phân đoạn ở đỉnh của phổ sắc ký bằng SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. Kết quả thu được ở hình 1B cho thấy, mỗi phân đoạn chỉ xuất hiện 1 băng protein duy nhất, có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết của GnRH-TBK là 30 kDa. Như vậy các phân đoạn protein ở đỉnh chứa hoàn toàn là GnRH-TBK và có độ tinh sạch cao. Kết quả Western blotting, các phân đoạn ở đỉnh cho phản ứng đặc hiệu với huyết thanh thỏ kháng TBK. Kết quả phân tích trình tự axit amin đầu N của GnRH-TBK tinh sạch cho thấy, ngoại trừ axit amin đầu tiên của protein tái tổ hợp là Meth, các axit amin tiếp theo là Glu, His, Trp, Ser, Tyr, Gly, Leu… Trình tự này cùng với kết quả Western blotting khẳng định protein thu được chính là protein lai GnRH-TBK. KẾT LUẬNImmunotoxin tái tổ hợp GnRH-TBK đã được biểu hiện ở mức khá cao trong E. coli chủng BL21(DE3) nhưng khác nhau ở các điều kiện thay đổi từ 22oC đến 37oC. Sau các bước sử lý đơn giản, GnRH-TBK dạng hoà tan có thể được tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion qua CM-Sepharose trên hệ FPLC. TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi (2003) // Di truyền và ứng dụng (đang in)2. Phan Văn Chi (2001) //Hội thảo Sinh học Quốc tế 2001, Hà nội, tr. 66-68.3. Phan Văn Chi, Hoàng Quốc Trường, Nguyễn Thuý Hà, Phạm Công Hoạt, Lê Trần Bình (2000) // Những vấn đề cơ bản trong sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 23-28.4. Phan Van Chi, Hoang Quoc Truong, Nguyen Thuy Ha, Won-II Chung and Le Tran Binh (2001) // Biotechnol. Appl. Biochem. 34: 85-92 5. Jean-Luc Schlick, Philippe Dulieu, Bénédicte Desvoyes, Pascale Adami, Jean Radom, Michéle Jouvenot// FEBS Letters 472 (2000) 241-246.6. Emos, G., Schrõder, B., Ortmann, O., Westphalen, S., Schultz, K.D. and Schally, A.V. (1993)//J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1458-1464.7. Quayum, A., Gullick, W., Clayton, R.C., Sikora, K. and Waxman, J. (1990) // Br. J. Cancer 62, 96-99.8. Imai, A., Ohono, T., Lida, K., Furui, T. and Tamaya, T. (1994) // Cancer 74, 2555-2561.9. Srkalovic, G., Bokser, L., Radulovic, S., Korkut, E. and Chally, A.V (1990)// Endocrinology 127, 3052-3060.10. Imai, A., Horibe, S., Takagi, A., Tadaki, H., Ohno, T., and Tamaya, T., (1997) // Eur. J. Obstet, Gynecol. Report. Biol.74, 73-78.11. Imai, A., Takagi, A., Horibe, S., Tagaki, H., and Tamaya, T. (1997) // Int. J. Oncol. 13, 97-100.12. Laemmli, U. K. (1970) // Nature, 227:680-685.13. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.SUMMARYPurification of recombinant fusion protein GnRH-TBK in E. coliImmunotoxins constitute a new modality for the treatment of cancer, since they target cells displaying specific surface-receptors or antigens. Immunotoxins contain a ligand such as a growth factor, monoclonal antibody or fragment of an antibody which is connected to a protein toxin. Toxins reviewed here include catalytic proteins produced by plants or bacteria which kill target cells (ricin, PAP or PE, DT…). Recently, we have isolated trichobakin (TBK), a type 1 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98 (Cucurbitaceae family) which reveals antiviral and anticancer activity once inside the cytoplasm. TBK was proved to be a good candidate for the construction of different fusion proteins as recombinant “immunotoxins”. A bacterial expression plasmid encoding TBK as a fusion protein with gonadotropin-releasing hormone (GnRH), a neuro-decapeptide with receptor sites on several gynaecologic tumors has been constructed. The fusion cDNA were amplified by PCR using specific primers designed from the DNA sequences of gnrh, linker and tbk genes and inserted into pET-21d(+) expression vector. This paper represents the results of the expression of the recombinant fusion protein GnRH-TBK in E. coli strain BL21 (DE3). The expression of the protein was assessed by analysis of total protein by SDS-PAGE. It was shown that at 22oC, GnRH-TBK was expressed mainly in soluble form, while at 30oC or 37 oC the protein was expressed in both soluble form and inclusion bodies. The recombinant proteins was purified to homogeneity by CM-Sepharose chromatography on FPLC System. The protein has the molecular mass of about 30 kDa and the specific immunoreactivity with antibodies against TBK as it was shown by SDS-PAGE and Western blotting. The specific activity/toxicity of the purified recombinant immunotoxin is under study. Người thẩm định nội dung khoa học: Ts. Nguyễn Bích Nhi Các phương pháp chiết rút tinh sạch và xác định protein I. Khái niệmTrong các tổ chức của cơ thể sống, protein có thể ở dưới dạng tự do trong các dịch sinh vật hoặc dưới dạng kết hợp, hoặc bị cầm trong các tế bào. Hơn nữa, trong tế bào có chứa hàng nghìn loại protein khác nhau, nếu ta cần nghiên cứu từng loại protein, trước hết phải chiết rút và tinh sạch chúng. Chính vì vậy, các kỹ thuật chiết rút, tinh sạch và nghiên cứu protein luôn ở vị trí trung tâm của các nghiên cứu hóa sinh và luôn được cập nhật và hiện đại hóa.II. Các biện pháp cần thiết để nhận protein nguyên thểCác phương pháp chiết rút và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan... của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết.Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau.2.1. Nhiệt độĐể tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Một điều cần lưu ý là chỉ nên dùng đối với trường hợp các protein enzyme bền với nhiệt. Dịch protein enzyme được giữ ở 50 - 700C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp.Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 00C tránh biến tính đặc biệt là protein enzyme.2.2. Nồng độ proton (pH)Protein là các chất lưỡng tính, vì vậy, trong các dung dịch acid và kiềm chúng sẽ bị phân ly như sau: Do các acid amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng các ion hóa là nguyên nhân tạo ra tính đa điện của protein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide không đáng kể, chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên (R) quyết định tính chất tích điện của phân tử protein (nhóm cacboxyl của amino acid, OH của Tyrosine, e - NH2 của lysine, guamidin của Arginine, inidazol của histidine)Mức độ ion hóa của các nhóm này phụ thuộc vào giá trị pH. Các nhóm acid ở dạng anion trong môi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường acid.Như vậy, ở một giá trị pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng không. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Điểm đẳng điện của các acid amin trung tính có giá trị pH từ 5,6 - 7,0; đối với các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là từ 3,0 - 3,2; đối với các acid amin có tính kiềm (diamino) là từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp.Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH của môi trường. Dịch protein enzyme được giữ ở pH £ 5 trong thời gian xác định. Protein tạp bị biến tính cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Ví dụ citochrom C cũng tan trong acid trichloracetic trong khi đó acid này làm kết tủa phần lớn protein. Như vậy các protein bền với acid có thể được tách chiết bằng cách này.2.3. Tác nhân hóa họcCó thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết các protein enzyme. Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein enzyme các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính. Dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 00C và có thể đến -200C, như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein enzyme.Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh.Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme. Loại muối này lại rẽ tiền và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bảo hòa 767g/l ở 250C)Ngoài ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau thì khác nhau nhiều.Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2SO4 bảo hòa hoàn toàn, còn amilase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bảo hòa của dung dịch muối này. Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác.Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bảo hòa. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. Khi dùng dung dịch bảo hòa, trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu, người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ở những nhiệt độ nhất định.Khái niệm về số phần trăm của độ bảo hòa hoàn toàn đã được đề cập đến. Như ví dụ trên thì protein enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ bão hòa hoàn toàn của (NH4)2SO4. Khi cho dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa vào dịch chiết protein enzyme thì nồng độ (NH4)2SO4 không tăng đột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buchner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca++ để làm bền protein enzyme (dùng CaCl2 hoặc Ca(CH3 COO)2Để tiện lợi, người ta đưa ra công thức cách tính lượng (NH4)2SO4 cho vào dịch có độ bão hòa cho trước (S1) để đạt đến một độ bão hòa cần thiết (S2)Tùy theo trạng thái (NH4)2SO4 cho thêm vào dịch chiết protein enzyme mà có công thức tính toán khác nhau.- Đối với (NH4)2SO4 ở dạng bộtx(g) = Trong đó V là thể tích dung dịch, S1, S2 là độ bão hòa cho trước và độ bão hòa cần đạt (ví dụ: S1 = 0,5; S2 = 0,7 chẳng hạn).Người ta cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để chiếu và xác định được lượng (NH4)2SO4 thêm vào để dịch chiết protein enzyme đạt được một độ bão hòa nhất định. Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn. Lượng (NH4)2SO4 đưa vào để dung dịch có độ bão hòa nhất định có khác nhau tùy theo nhiệt độ thí nghiệm.- Đối với (NH4)2SO4 ở dạng dung dịch bão hòa.Thể tích (tính theo ml) của dung dịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hòa ban đầu S1 để đạt đến một độ bão hòa S2 cần thiết được tính theo công thức sau:V(ml) = Như vậy, nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 (có nồng độ bão hòa khác nhau) thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein enzyme. Tuy nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên. Mặc dầu vậy, cách kết tủa từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và làm sạch protein emzyme, vì phương pháp khá đơn giản.Ngoài ra, các tác động khác như cơ học, sóng siêu âm... có ảnh hưởng đến quá trình tách chiết protein emzyme.III. Phá vỡ tế bào và chiết rút protein3.1. Phá vỡ tế bàoProtein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào). Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v...) của tế bào. Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày. Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào. Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiên đồng thể (homogenizator). Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với một môtơ quay và có thể điều chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữa chày thùy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy.Để việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước. (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết protein enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết.Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, gly