Tóm tắt Luận án Ảnh hưởng của nhiệt độ, điều kiện oxy thấp, co2 cao trong môi trường lên hô hấp và sinh lý của cá thát lát còm chitala ornata (gray,1831)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ NGÀNH: 9 62 03 01 ĐẶNG DIỄM TƯỜNG ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ, ĐIỀU KIỆN OXY THẤP, CO2 CAO TRONG MÔI TRƯỜNG LÊN HÔ HẤP VÀ SINH LÝ CỦA CÁ THÁT LÁT CÒM CHITALA ORNATA (GRAY,1831) Cần Thơ, 2018 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC THỰC HIỆN VÀ HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: GS.TS. Trần Ngọc Hải Người hướng dẫn phụ: PGS.TS. Mark Bayley PGS.TS. Do Thi Thanh Huong Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc: .. giờ .. ngày .. tháng .. năm .. Phản biện 1: . Phản biện 2: . Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Tuong, D. D., Borowiec, B., Clifford, A. M., Filogonio, R., Somo, D., Phuong, N. T., . . . Milsom, W. K. (2018a). Ventilatory responses of the clown knifefish, Chitala ornata, to hypercarbia and hypercapnia. Journal of Comparative Physiology B, 1-9. 2. Tuong, D. D., Ngoc, T. B., Huynh, V. T. N., Phuong, N. T., Hai, T. N., Wang, T., & Bayley, M. (2018b). Clown knifefish (Chitala ornata) oxygen uptake and its partitioning in present and future temperature environments. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 216, 52-59. 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu chung Biến đổi khí hậu đang thách thức và đe dọa sự sống của động vật thủy sinh thông qua việc tăng nhiệt độ của môi trường nước và sự gia tăng nồng độ CO2. Các dự báo gần đây của hội đồng quốc tế về biến đổi khí hậu (IPCC, 2014) cho rằng vùng đồng bằng sông Cửu Long nhiệt độ sẽ tăng 2,5-3,5°C trong 100 năm tới; và đồng thời, nồng độ CO2 trong khí quyển cao sẽ tăng lên với tốc độ 3% mỗi năm. Các dự báo chỉ ra rằng việc tăng nhiệt độ môi trường nước có thể tác động tiêu cực đến các chức năng hệ sinh thái biển và nước ngọt (Roessig và ctv., 2004; Brander, 2007; Rijnsdorp và ctv, 2009; PÖrtner & Peck, 2010; Hofmann và Todghram, 2010; Madeira và ctv, 2012; Crozier & Hutchings, 2014; Lefevre và ctv, 2016) và cả hệ sinh thái cá thông qua các tác động về sinh lý, hô hấp, trao đổi chất, nguồn thức ăn, tăng trưởng, hoạt động phản ứng, sinh sản và/hoặc tử vong (Watts và ctv. , 2001; Cnaani, 2006; Sigh và ctv, 2013; Reid và ctv, 2015). Trong khi nhiệt độ được coi là một yếu tố quan trọng trong việc kiểm soát yếu tố vật lý để xác định sự phân bố của động vật, nồng độ CO2 của môi trường tăng (hypercarbia) thì lại liên quan đến sự mất cân bằng acid-base, giảm pH nước và các tác động lên tim mạch cũng như thay đổi hô hấp (Gilmour, 2001; Claiborn và ctv, 2002; Ishimatsu và ctv, 2005; Brauner và Baker, 2009; Talmage & Gobler., 2011; Nowicki và ctv, 2012; Milson, 2012; Munday và ctv, 2012). Tuy nhiên, thay đổi sinh lý và khả năng thích ứng của động vật thủy sinh được xem là mục tiêu thú vị để nghiên cứu về tác động của sự tăng nhiệt độ và tăng nồng độ CO2 trong môi trường nước. Giả thuyết về sức tải O2 bị giới hạn bởi khả năng chịu đựng nhiệt độ được đề ra nhằm thể hiện các tác động tiêu cực của sự tăng nhiệt độ lên cá mà cơ chế nằm ở sự phân phối oxy đến các mô (Portner, 2001; Portner và Farrell, 2008; Munday và ctv., 2008; Munday và ctv., 2009; Nilsson và ctv, 2009; Portner, 2010; Neuheimer và ctv, 2011). Đó là do nồng độ oxy hòa tan giảm khi nhiệt độ môi trường nước gia tăng trong khi nhu cầu oxy của cá tăng đáng kể khi nhiệt độ khi nhiệt độ môi trường tăngcao. Do đó, nhiệt độ tăng kết hợp với tình trạng thiếu oxy (giảm mức độ oxy hòa tan) đã cho thấy có thể gây ra tác động nghiêm trọng đến sinh vật dưới nước trong quá trình hô hấp trao đổi chất và dẫn đến kết quả là ảnh hưởng đến các kiểu biểu hiện của cá (McBryan và ctv, 2013). Ngoài ra, người ta cho rằng cá ở các vùng nhiệt đới có thể bị ảnh hưởng nghiêm trọng vì chúng đã sống gần giới hạn nhiệt độ trên và có thể dễ bị tổn thương hơn với các mức nhiệt độ tăng dù là nhỏ (Nelson và ctv, 2016; Tewksbury và ctv ., 2008). Tuy nhiên, ngày càng có bằng chứng về các nghiên cứu không phù hợp với giả thuyết đó (Clark và ctv, 2013; Norin và ctv, 2014; Wang và ctv, 2014; Lefevre, 2016). Thật vậy, người ta cho rằng các loài cá hô hấp khí trời có khả năng chịu nồng độ oxy thấp có thể đó là kết quả của sự tiến hóa dưới tác động 2 của nhiệt độ cao hơn và áp suất oxy trong khí quyển thấp hơn so với hiện tại. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự tăng nhiệt độ và tình trạng thiếu oxy lên quá trình trao đổi chất của cá hô hấp khí trời rất quan trọng trong việc đánh giá các tác động của biến đổi khí hậu. Một khía cạnh khác của khả năng thích ứng với các yếu tố môi trường, đã cho rằng một trong những cơ chế thích nghi là khả năng thay đổi hình thái mang (Tuurala và ctv, 1998, Sollid và ctv, 2003; Sollid và ctv, 2005; Sollid và Nilsson. , 2006; Ong và ctv, 2007; Matey và ctv, 2008; Mitrovic và Perry, 2009). Các nghiên cứu chuyên sâu về khả năng này đã được tìm thấy ở các loài cá hô hấp trong nước bao gồm cá chép, cá vàng và cá hồi mà mang của chúng có thể tăng hoặc giảm khối lượng tế bào interlamellar (ILCM) để tăng hoặc giảm diện tích bề mặt hô hấp. Khả năng này của cá rất thú vị với các nhà khoa học rằng sự biến đổi cấu trúc mang là một xu hướng hiện đại hay một đặc điểm cổ xưa (Nilsson, 2007; Nilsson và ctv, 2012). Các giả thuyết cũng được đề xuất rằng việc biến đổi cấu trúc mang có thể là một đặc điểm cổ xưa do quá trình tiến hóa tiến hóa trong quá khứ khi một số loài cá hô hấp khí trời được tìm thấy cũng có thể biến đổi hình thái mang của chúng để thích nghi với những thay đổi môi trường (Brauner và ctv ., 2004; Ong và ctv, 2007; Huang và Lin, 2011; Phuong và ctv, 2017, 2018). Vấn đề này rất quan trọng và cần được tìm hiểu trên C. ornata bởi loài này là một loài cá cổ tồn tại ít nhất 300 triệu năm trước (Near và ctv, 2012) sẽ giúp đưa ra dự đoán tổng quan cho các loài cá khác. Mức độ tăng CO2 trong khí quyển được ước tính là đang tăng lên hàng năm do sự nóng lên toàn cầu. Hàm lượng CO2 được hòa tan trong nước lớn hơn nhiều so với oxy do đó, với sự gia tăng nhỏ của mức CO2 trong khí quyển, sẽ dẫn tới một sự gia tăng đáng kể mức độ CO2 hòa tan có thể được tạo ra trong các môi trường nước. Đã có báo cáo rằng mức độ PCO2 ở ĐBSCL dao động từ 0,02-0,6% (Li và ctv, 2013) đang ảnh hưởng đến đời sống của cá. Trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản, các hệ thống nuôi thâm canh và siêu thâm canh đang được ứng dụng đã và đang dẫn đến tình trạng tăng cao CO2 trong môi trường (hypercarbic) khoảng 30 mmHg vào cuối chu kỳ sinh trưởng (Damsgaard và ctv, 2015). Tiếp xúc hypercarbic thường gây ra phản ứng khác nhau trên từng loài cá cụ thể. Các phản ứng tim mạch mà được cho là được điều khiển bởi cơ quan thụ cảm CO2/H + trung tâm ở các loài cá hô hấp khí trời không bắt buộc vẫn còn rất mơ hồ và chưa rõ ràng. Tác động của hypercarbia và hypercapnia lên phản ứng tim mạch, từ số hô hấp khí trời và phản ứng pH, PCO2 cũng như vị trí thụ cảm CO2 / H + là rất quan trọng để điều tra. Clown knifefish (C.ornata), một loài cá hô hấp khí trời ở vùng nhiệt đới (Deharai, 1962; Tuong và ctv, 2018b) đã được chọn để thực hiện các nghiên cứu dưới các mức nhiệt độ trung bình hiện tại (27°C) và nhiệt độ dự đoán tăng cao (33°C), kết hợp với thiếu oxy, điều kiện hypercarbia trong môi trường nước, hypercapnia bên trong cơ thể cá để xem xét cá phản ứng hô hấp trao đổi chất, biến đổi cấu trúc mang và các biểu hiện thích nghi cũng như tăng trưởng, phản ứng tim mạch và định hướng vị trí của thụ cảm CO2/H+. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 3 Mục tiêu chính của luận án này là đánh giá tác động của biến đổi khí hậu (trong trường hợp nhiệt độ cao, thiếu oxy, tăng CO2) lên C.ornata như là các phản ứng của quá trình trao đổi chất, phản ứng hô hấp tim mạch,biến đổi cấu trúc mang và tăng trưởng. Cụ thể, hô hấp của Clown knifefish ở 27°C và 33°C kết hợp với normoxia và hypoxia đánh giá thông qua SMR, tỷ lệ hô hấp khí trời, giá trị Q10, tiêu hao oxy khi tiêu hóa thức ăn (SDA) và tăng trưởng. Do đó, để hiểu và giải thích cách thích ứng với hô hấp cá với nhiệt độ cao và tình trạng thiếu oxy, hình thái mang được nghiên cứu thông qua khả năng biến đổi cấu trúc và ước tính diện tích bề mặt hô hấp, khoảng cách khuyetech tán. Phản ứng của cá đối với hypercarbia và hypercapnia được tiến hành để đánh giá các thông số phản ứng hô hấp tim mạch cũng như xác định thụ cảm CO2/H + . 1.3. Nội dung/hoạt động nghiên cứu Nghiên cứu này bao gồm 4 hoạt động/nghiên cứu chính: 1) Thứ nhất, đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ cao lên áp suất cục bộ quan trọng (Pcrit), tỷ lệ chuyển hóa tiêu chuẩn (SMR), hoạt động hoặc tiêu hóa cụ thể (SDA) (sử dụng hô hấp liên tục hai lần); và về sự tăng trưởng của cá (trong hệ thống nuôi trồng thủy sản tuần hoàn). 2) Thứ hai, điều tra hình thái mang thông qua ước tính diện tích bề mặt nhánh, khối lượng và độ dày khuếch tán máu nước dưới tác động của nhiệt độ cao và phương pháp áp dụng phương pháp stereology. 3) Thứ ba, phản ứng hô hấp tim mạch của C. ornata đối hypercarbia (PCO2 cao trong môi trường nước) và hypercapnia (PCO2 cao trong máu [H +]/PCO2) cũng như xác định vị trí của thụ cảm CO2/H + điều khiển phản ứng hô hấp tim mạch ở C. ornata. 4) Cuối cùng, tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của hypercarbia và hypercapnia đối với đáp ứng hô hấp tim mạch của C. ornata trong việc xác định vị trí của thụ cảm CO2/H + ở C. ornata. 4 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP Nghiên cứu 1: Cá thát lát còm (Chitala ornata) tiêu hao oxy và tiêu hao oxy từng phần ở môi trường hiện tại và dự đoán môi trường trong tương lai. Cá: Đối với các thí nghiệm tiêu hao oxy, các cá thể cá có trọng lượng 60-100 g được chọn, trong khi các thí nghiệm tăng trưởng có trọng lượng bắt đầu từ 35-45 g được chọn. Hô hấp: Tiêu hao oxy (ṀO2, mgO2kg -1 h -1 ) được đo bằng cách sử dụng hệ thống tiêu hao oxy bán kín từng phần được mô tả trong các nghiên cứu của Lefevre và ctv. (2011, 2014a, 2014b, 2016). Các bố trí thí nghiệm: trong thí nghiệm xác định Pcrit và sự lựa chọn nồng độ thiếu oxy: Trong một thử nghiệm ban đầu, chúng tôi đã xác định một mức độ thiếu oxy thích hợp để kích thích sự phụ thuộc vào hô hấp khí trời được sử dụng trong các thí nghiệm còn lại. Cá được đặt trong bể và nhịn ăn ở 27 hoặc 33°C trong 48 giờ trước khi đo. Tám con cá từ mỗi chế độ nhiệt độ được đặt trong buồng đo hô hấp và ṀO2 được đo trong 19 giờ gồm có đo hô hấp trong nước và không khí. Sau đó, giai đoạn phần không khí được loại bỏ bằng cách làm ngập buồng, tuần hoàn nước qua buồng đo hô hấp, và mức độ oxy trong nước được theo dõi cho đến khi cá bị mất cân bằng vào thời điểm đó cá được trả về bể chứa. Mất cân bằng xảy ra sau 3-4 h. Áp suất oxy (Pcrit) cho mỗi cá được tính bằng giao điểm của SMR của từng cá thể (SMR được tính toán bằng cách sử dụng mẫu công thức chạy R của Chabot và ctv. (2016)) khi đo tiêu hao oxy tổng từ không khí và nước, và phần tiêu hao oxy khi không có hô hấp không khí (Lefevre và ctv., 2011). Theo đó, mức thiếu oxy sau đó được sử dụng là 4,7 kPa ở 27°C và 6,0 kPa ở 33°C. Nhiệt độ thích nghi: Trong các thí nghiệm tiếp theo, cá đã thích nghi với nhiệt độ đo tối thiểu 30 ngày để loại bỏ các phản ứng nhiệt độ có thể xảy ra trong các nghiệm thức đo tiêu hao oxy. Sự trao đổi chất và hô hấp từng phần trong quá trình tiêu hóa thức ăn: 12 con cá (N=6 ở mỗi nhiệt độ) được cho nhịn đói ở nhiệt độ thích hợp trong 48 h và ṀO2 riêng lẻ được đo như mô tả ở trên trong 20 h trong nước normoxic (~ 150 mmHg). Sau đó, cá được cho ra ngoài và tiến hành đo tiêu thụ oxy của vi khuẩn được đo trong 1 h. Đến cuối giai đoạn này, cá được cân lại và cho cá ăn 2% khối lượng cơ thể sử dụng thức ăn viên nổi (43% protein, 13,39 kJ kg-1; Stella S3, Nutreco company, Hồ Chí Minh, Việt Nam). Cá sau đó được cho lại buồng đo và tiêu hao oxy trong 45 giờ tiếp theo. Tại thời điểm này, tiêu hao oxy của vi khuẩn được đo lại. SMR được tính toán từ giai đoạn đo đầu tiên như mô tả ở trên và SDA (tiêu hao năng lượng cho tiêu hóa thức ăn)được tính bằng cách trừ đi SMR này từ ṀO2 đo khi cá tiêu hóa thức ăn. Diện tích của SDA được tính toán bằng phương pháp trapezoid được mô tả trong 5 Lefevre và ctv. (2012). Thời gian của SDA được tính từ điểm mà cá được cho trở lại buồng cho đến khi tổng ṀO2 giảm về SMR+2 S.E.M. SDA được ước tính bằng cách tính diện tích tổng ṀO2 và đường cong SMR bằng phương pháp trapezoid. SDA được chuyển thành năng lượng tương đương như năng lượng tiêu hao và hệ số SDA (tiêu hao năng lượng SDA chia cho tổng năng lượng có trong thức ăn) chuyển thành kJ sử dụng hệ số oxy hóa 13,56 kJ mgO2 -1 cho động vật ăn thịt (Elliott và Davison, 1975). Tăng trưởng: 120 con cá (41,2±0,3 g, trung bình±S.E.M) được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm. Sau khi gắn vi chip FDX-B (hệ thống Loligo, Đan Mạch) và ghi khối lượng và chiều dài cơ thể, cá được nuôi trong hệ thống nuôi tuần hoàn ở 27±0,5 hoặc 33±0,5°C kết hợp với điều kiện oxy bão hòa và tình trạng thiếu oxy (5 kPa) trong bể 2000 L. Mức oxy thấp (PO2 mong muốn) được điều chỉnh bằng cách sục khí nitơ vào bể dưới sự kiểm soát của hệ thống Oxyguard Pacific (Oxyguard, Đan Mạch). Khối lượng và chiều dài của cá được đo lại sau 1, 2 và 3 tháng. Xử lý hống kê: Số liệu được phân tích bằng Sigmaplot 12.5. Số liệu được kiểm tra phân phối chuẩn và đồng nhất phương sai khi sử dụng phép thử Shapiro-Wilks, số liệu % tiêu hao oxy trong không khí được chuyển hóa arcsine. ANOVA hai chiều được sử dụng để kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ oxy và sự tương tác của nhiệt độ và nồng độ oxy trên SMR, RMR và % không khí hấp thụ và trong các nghiệm thức thì được kiểm tra bằng cách sử dụng nhiều quy trình so sánh Holm- Sidak. Student t test được sử dụng để so sánh các giá trị trung bình trong các thí nghiệm SDA. Tăng trưởng và tốc độ tăng trưởng cụ thể (SGR) đã được kiểm tra bằng cách sử dụng one way ANOVA lặp lại (RM). Giá trị trung bình của SMR và RMR được so sánh bằng cách sử dụng Student t-test. Dữ liệu được trình bày bằng giá trị trung bình±S.E.M. Xác suất (giá trị p) của P <0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê. Nghiên cứu 2: Biến đổi cấu trúc mang cá thát lát (Chitala ornata) dưới tác động của nhiệt độ và tình trạng thiếu oxy Cá: 120 cá thát lát (33,1±1,13 g) Bố trí thí nghiệm: cá được chọn ngẫu nhiên và thả vào bốn bể (2 m3) của hệ thống nuôi tuần hoàn (RAS) ở 27°C. Cá được cho ăn thức ăn viên thương phẩm 43% protein (Stella S3, Công ty Nutreco, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam) hai lần/ ngày cho đến khi cá thỏa mãn. Sau 3 ngày trong môi trường oxy cao ở 27°C, sáu mang cá được lấy mẫu và bảo quản trong 10% dung dịch formalin phosphate (10% formalin PBS) để làm mẫu đối chứng. Sau đó, nhiệt độ và mức oxy được điều chỉnh để tạo ra bốn nghiệm thức 27°C và normoxia (độ bão hòa oxy 95%), 27°C và thiếu oxy (độ bão hòa oxy 25%), 33°C và normoxia (độ bão hòa oxy 95%) và 33 °C và thiếu oxy (độ bão hòa oxy 30%) (Tuong và ctv., 2018). Tiếp theo mang cá được lấy mẫu sau một và hai tháng (N=6 cho mỗi nghiêm thức). Khối lượng và chiều dài của thân cá cũng được ghi lại. Xử lý mẫu mang và quy trình stereologyl: Phương pháp 6 được bố trí theo da Costa và ctv. (2007) để xử lý, đúc khối và cắt mẫu mang được thực hiện trên các mẫu mang C. ornata. Ước lượng theo Cavalieri và lấy mẫu ngẫu nhiên thống nhất theo chiều dọc –VUR được sử dụng để giảm lượng mẫu (Baddeley và ctv, 1986). Mang cá được chọn ngẫu nhiên để lấy bên mang bên trái hoặc bên phải. Có năm cung mang ở mỗi bên mang của C. ornata, trong khi cung mang thứ năm hoàn toàn tiêu giảm. Do đó, hai cung mang (đầu tiên hoặc cung mang thứ hai và cung mang thứ ba cung thứ tư) được chọn và cắt bỏ phần sụn cứng cẩn thận. Các mô mang còn lại được cân khối lượng và sau đó cồn được xử dụng để xử lý loại bỏ nước trong mang. Sau đó, methyl methacrylate Technovit 7100 (Heraeus Kulzer, Đức) được sử dụng để đúc khối các mẫu mang. Mỗi khối đúc chứa 4 mô mang từ hai con cá, khối có mặt phẳng nằm ngang song song với mặt bên của mô động mạch bên và trục thẳng đứng vuông góc với mặt phẳng nằm ngang này. Mỗi mô mang sau đó được quay 40°so với mô trước đó. Mỗi khối được chia theo chiều dọc để lấy 8 phần và mỗi lát cắt có độ dày 3 µm và khoảng cách từ một phần được chọn đến phần khác là như nhau (da Costa và ctv., 2007). Các dung dịch Hematoxylin và Eosin được sử dụng để nhuộm sau khi các mẫu này được sấy ở nhiệt độ 55 °C trong 24 giờ. Các mẫu sau đó được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm lập thể mớiCast VIS (Hệ thống tích hợp Visiopharm, Olympus, Đan Mạch). Khối lượng tham chiếu của các yếu tố đo lường được trên mang, diện tích bề mặt hô hấp của lá mang và khoảng cách khuếch tán. Xử lý thống kê: Số liệu được phân tích bằng SPSS 18.0. Two- way ANOVA được sử dụng để kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ oxy và sự tương tác của nhiệt độ và nồng độ oxy lên diện tích của lamella, thể tích mang và khoảng cách khuếch tán. Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình±S.E.M (sai số chuẩn). Xác suất (giá trị p) <0,05 được cho là khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nghiên cứu 3: Phản ứng hô hấp tim mạch của cá thát lát còm, Chitala ornata lên tác động của hypercarbia và hypercapnia Cá: cá thát lát còm (708±92 g) Chuẩn bị cá: Cá được gây mê trong dung dịch benzocain (0,35 ml L-1). Trong khi tiến hành phẩu thuật cá vẫn được duy trì gây mê nhẹ, động mạch chủ lưng được đặt ống polyethylene để lấy máu (PE 50; ID 0,4 mm, OD 0,8 mm) trong ống có chứa dung dịch heparin (50 IU/ml) pha trong nước muối 9% (Soivio và ctv., 1975). Một ống polyethylene thứ hai (PE 100) dùng để đo áp suất khoang miệng cũng được đưa vào khoang miệng thông qua một lỗ trên da giữa góc của hàm dưới và cũng được cố định bằng chỉ y tế. Cuối cùng, hai cảm biến rung động điện trở được lắp vào hai bên nấp mang để ghi nhận hoạt động của mang và cũng được cố định bằng chỉ y tế. Bố trí thí nghiệm: Sau phẫu thuật, cá được cho hồi phục trong 24 giờ và ngày sau đó, cá được chuyển vào bể thí nghiệm. Các cảm biến điện trở được kết nối với một bộ chuyển đổi trở kháng và ống thông khoang miệng được kết nối với một bộ chuyển đổi áp suất để đo áp suất nước thông qua và tần số hô hấp khí trời (hơi thở min-1). 7 Ống đút ở động mạch chủ được kết nối với bộ chuyển đổi áp suất để ghi lại nhịp tim (nhịp đập min-1) và huyết áp (cm H2O) và là nơi rút máu để phân tích (PCO2 và pH) sử dụng máy phân tích VetScan i-STAT (Abaxis) Thành phố Union, CA, Hoa Kỳ). Ống này cũng được sử dụng để tiêm chất ức chế anhydrase carbonic, acetazolamide. Các bộ chuyển đổi áp suất được hiệu chuẩn theo phương pháp manometrically, được kết nối với các bộ khuếch đại và tất cả các đầu ra được theo dõi và ghi lại với một hệ thống thu thập dữ liệu (Dataq DI-720, DATAQ Instruments, Inc., Akron, OH, USA) ghi ở 125 Hz cho mỗi kênh. Cá (N=8) đầu tiên được thí nghiệm với môi trường nước có độ pH là 7,8 (độ pH của nước trong bể nơi cá được trữ). Sau khi theo dõi phần đối chứng ít nhất trong 30 phút, H2SO4 được bổ sung từ từ để giảm pH nước xuống 6.0 trong khoảng 15-30 phút. Mức pH thấp này sau đó được duy trì trong 1 giờ, trong đó nhiệt độ và pH được đo liên tục. Cá sau đó được đưa trở lại bể chứa và được phục hồi trong 24 giờ trước khi tiếp xúc với nghiệm thức CO2 cao. Ngày hôm sau, cá (N=8) được tiếp xúc với môi trường CO2 cao theo quy trình tương tự như nghiệm thức pH thấp. Đối chứng được ghi nhận tối thiểu 30 phút. Sau đó tiến hành sục khí CO2 (99% tinh khiết) vào trong môi trường nước để hạ pH (pH=6,0) tương đương mức pH thấp trong nghiệm thức bổ sung H2SO4. CO2 được bổ sung từ từ (khoảng 30 phút) cho đến khi độ pH của nước đạt đến mức pH là 6,0. CO2 được điều chỉnh để duy trì độ pH của nư