Tóm tắt luận án Dịch tễ học phân tử bệnh lao tại Việt Nam (2003-2009)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ VÂN ANH DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM (2003-2009) Chuyên nghành:Y tế công cộng Mã số: 62.72.03.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y TẾ CÔNG CỘNG HÀ NỘI - 2012 Công trình được hoàn thành tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Đặng Đức Anh 2. GS. TS. Trần Văn Sáng Phản biện 1: PGS. TS. Đoàn Huy Hậu, Học viện Quân Y Phản biện 2: PGS. TS. Bùi Đức Dương, Bộ Y tế Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Thị Tuyến, Đại học Y Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ tạị hồi đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Vào hồi 9 giờ sáng, ngày 19 tháng 9 năm 2012 Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện quốc gia 2. Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 3. ............. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFB Acid Fast Bacillus Trực khuẩn kháng axit AIDS Arquired Immuno- deficiency Syndrom Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải CAS Central Asian Trung Á CR Clustering rate Tỷ lệ tạo cụm DR Direct Repeat Lặp lại trực tiếp EAI East African Indian Đông Phi Ấn EMB Ethambutol Ethambutol INH Isoniazid Isoniazid IS Insertion Sequence Đoạn xen LAM Latin American and Mediterranean Mỹ la tinh và Địa trung hải LSP large-Sequence Polymorphisms Đa hình trình tự lớn MIRUs- VNTR Mycobacterial Interspered Repetitive Units - Variable Number of Tandem Repead Đoạn lặp rải rác chứa đơn vị lặp lại liên tiếp đa dạng thuộc Mycobacteria MPTR Major Polymorphic Tandem Repeat Trình tự lặp lại liên tiếp đa dạng chủ yếu SNP Synonymous Single Nucleotide polymorphisms Điểm đa hình PAUP Phylogenetic Analysis Using Parsimony Phân tích phả hệ sử dụng Parsimony PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PGRS Polymorphic GC-rich Repetitive Sequence Trình tự lặp lại đa dạng giầu GC RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Đa hình độ dài đoạn giới hạn RMP Rifampicin Rifampicin SM Streptomycin Streptomycin SpolDB4 Spoligotyping database 4 Cơ sở dữ liệu spoligotyping 4 ST Spoligotype Typ spoligo VNM Vietnam Viet Nam WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đến nay bệnh lao vẫn là nguyên nhân gây tử vong thứ hai, sau bệnh AIDS trong số bệnh nhiễm khuẩn, gây ra khoảng 2 triệu ca tử vong mỗi năm trên toàn thế giới. Theo báo cáo của WHO năm 2010, ước tính Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất toàn cầu. Trong khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippin về số lượng ca lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm. Các phác đồ điều trị hiệu quả đã làm giảm nhanh tỷ lệ mắc lao ở các nước phát triển. Vì vậy 85% số ca bệnh trên toàn cầu hiện nay tập trung tại các nước đang phát triển. Trên thực tế, cùng với tăng dân số, biến động chính trị, di cư, sự phát triển của lao kháng thuốc và đại dịch HIV/AIDS, số ca mắc lao ở thời điểm hiện tại lớn hơn số ca mắc lao tại bất kỳ thời điểm nào trong lịch sử loài người. Đáng buồn là phương tiện để khống chế bệnh lao hiện nay là một kỹ thuật xét nghiệm đã 100 năm tuổi, một vắc xin sử dụng cách đây 80 năm và những loại thuốc đã được áp dụng từ 50 năm trước. Những công cụ này không đáp ứng được mục tiêu thanh toán lao, vì thế cần phải có những công cụ hiệu quả hơn. Trong công cuộc loại trừ bệnh lao, dịch tễ học phân tử bệnh lao đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nền tảng cơ sở khoa học cho xây dựng và phát triển các công cụ mới đồng thời xây dựng chiến lược kiểm soát phù hợp và hiệu quả. Các cơ sở khoa học bao gồm sự khác biệt về cấu trúc quần thể vi khuẩn lao lưu hành tại mỗi mỗi khu vực ảnh hưởng như thế nào tới hiệu quả của chiến lược phòng chống bệnh trong đó có điều trị, phát triển vắc-xin, thuốc chống lao và các phương tiện chẩn đoán; Vi khuẩn lao trẻ em có khác biệt gì so với vi khuẩn lao người lớn; Sự khác biệt này có ảnh hưởng gì tới chiến lược phát triển vắc-xin; Các chủng lao thuộc các dòng các typ phân tử khác nhau có vai trò thế nào trong dịch tễ học bệnh lao tại mỗi khu vực địa lý; Động năng của quá trình lây truyền bệnh trong cộng đồng như thế nào; Nhóm nào là nhóm nguy cơ cao. Những yếu tố nguy cơ nào gây ra sự lan truyền bệnh lao.Yếu tố nguy cơ nào có thể dự phòng được. Dịch tễ học phân tử bệnh lao đã được nghiên cứu tại nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật phân tử để phân loại, xác định đặc tính phân tử chủng vi khuẩn lao để đánh giá tình hình bệnh lao, sự phân bố của vi khuẩn lao kiểu gen Bắc Kinh và mối liên quan đến tính kháng thuốc. Nghiên cứu này đã phân tích tình hình dịch tễ học phân tử của bệnh lao trên nhiều khía cạnh ở Việt Nam dựa trên phân 2 tích yếu tố căn nguyên vi khuẩn và thông tin dịch tễ. Nghiên cứu sử dụng các công cụ phân tích phân tử cập nhật nhất hiện thời và các kỹ thuật phân tích thống kê mạnh nhất nhằm đạt được các mục tiêu sau: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Mô tả đặc điểm phân bố dòng, dưới dòng của vi khuẩn lao lưu hành tại một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009. 2. Xác định mức độ kháng thuốc của các dòng, xác định phân bố dòng của quần thể theo mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2005-2008. 3. Tìm hiểu đặc điểm chủng vi khuẩn lao phân lập từ trẻ em, giai đoạn 2005-2009. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đa dạng phân tử vi khuẩn lao một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ. - Phát hiện các trường hợp tái nhiễm lao. - Điểm khác biệt dịch tễ học phân tử bệnh lao giữa ba khu vực nghiên cứu tại ba miền Bắc, Trung và Nam. - Mức độ kháng thuốc của các dòng vi khuẩn lao tại 3 miền Bắc, Trung và Nam. - Phân bố dòng và typ phân tử theo mức độ kháng thuốc. - Tương quan của các kháng thuốc trong vi khuẩn lao Việt Nam. - Đặc điểm chủng vi khuẩn lao phân lập từ trẻ em, so sánh với chủng lao người lớn. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Mô tả được đặc điểm phân bố dòng/ dưới dòng của vi khuẩn lao đang lưu hành tại khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009. Ảnh hưởng của khu vực, (thành phố, nông thôn), vùng, miền (đồng bằng Bắc bộ, miền Bắc, Trung, Nam), và cách chọn mẫu (Bệnh viện, cộng đồng) đến phân bố của vi khuẩn lao. - Phát hiện về tái nhiễm lao trong điều trị và quản lý bệnh lao. - Cho biết mức độ kháng thuốc của các dòng lao khác nhau tại ba miền Bắc, Trung và Nam;Cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở các mức độ kháng thuốc khác nhau;Sự phối hợp của các kháng thuốc trong công thức kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam. - Mức độ kháng thuốc và đặc điểm phân tử của chủng vi khuẩn lao trẻ em; Điểm khác nhau giữa vi khuẩn lao trẻ em và vi khuẩn lao người lớn. 3 CẤU TRÚC LUẬN ÁN Đặt vấn đề: 3 trang Chương 1. Tổng quan: 58 trang Chương 2. Đối tượng và phương pháp: 24trang Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 39 trang Chương 4. Bàn luận: 40 trang Kết luận: 2 trang Kiến nghị: 1 trang Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Dịch tễ học bệnh lao Bệnhlao gây bởi vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Vi khuẩn lao có kích thước 0,5 x 2-5µm, không vỏ, không lông và không sinh nha bào, hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển nội bào. Thời gian cho một chu trình phân chia từ 12 đến 18 giờ. Bệnh lao lây theo đường hô hấp, ăn uống và tiếp xúc qua da tuy hiếm gặp. Nguồn lây chủ yếu là bệnh nhân lao phổi soi kính có AFB dương tính. Mỗi năm có khoảng 9 triệu trường hợp lao mới và 2 triệu ca tử vong, trong đó 0,4 triệu là bệnh nhânHIV dương tính. Bệnh lao có mặt ở tất cả các quốc gia trên thế giới nhưng tập trung chủ yếu tại châu Phi (30%) và châu Á (55%). Tám mươi phần trăm tổng số ca trên toàn cầu thuộc về 22 nước có tỷ lệ bệnh lao cao nhất. Số lao kháng đa thuốc khoảng 0,4-0,5 triệu, số lưu hành lớn gấp 2-3 lần.Tính tới tháng 1/ 2010, số quốc gia thông báo có lao siêu kháng thuốc là 58. Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất toàn cầu, thứ ba sau Trung Quốc và Philippin trong khu vực Tây - Thái Bình Dương.Năm 2010, tỷ lệ tử vong do lao là 36/100.000, tỷ lệ mắc lao các thể là 333/100.000 tỷ lệ lao mới mắc các thể là 200/100.000 và tỷ lệ phát hiện đạt 54%. Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao năm 2002 khoảng 3,2%, năm 2007 là 4,4%. Tỷ lệ kháng thuốc chung năm 2002 là 32,5%, tỷ lệ đa kháng là 3% ở bệnh nhân mới và 23,5% ở bệnh nhân tái trị. Năm 2009, tỷ lệ này là 2,7% và 19%. 1.2. Cấu trúc quần thể vi khuẩn gây bệnh lao 1.2.1. Cấu trúc di truyền nhiễm sắc thể vi khuẩn lao Các yếu tố di truyền lặp lại, các điểm đa hình và các đoạn đa hình trong vi khuẩn lao M. tuberculosis là marker quan trọng sử dụng cho phân loại vi khuẩn. Đoạn xen (IS) là các trình tự di động nhỏ hơn 2,5kb xuất hiện phổ biến trên nhiễm sắc thể. Trình tự lặp lại đa dạng giầu GC (PGRS)gồm nhiều đoạn dài 96 bp giầu GC lặp lại liên tiếp cùng chiều, có 4 mặt tại ít nhất 26 vị trí. Vùng lặp lại trực tiếp (vùng DR)bao gồm những đoạn lặp lại trực tiếp, cấu tạo bởi một trình tự ngắn dài 36bp lặp lại với tần suất lặp lại khác nhau ở mỗi đoạn. Xen giữa các đoạn lặp lại là các đoạn trung gian dài 35- 41 bp không lặp lại.Trình tự lặp lại liên tiếp đa dạng chủ yếu (MPTR)làtrình tự lặp lại của một đoạn ngắn dài 10 bp, phân tách nhau bởi đoạn trung gian dài 5 bp, có số lượng có thể lên tới 80 copy. Đoạn lặp rải rác chứa đơn vị lặp lại liên tiếp đa dạngthuộc Mycobacteria (MIRU- VNTR)chứa các đơn vị có kích thước từ 40-100 bp lặp lại liên tiếp, với tần suất lặp lại đa dạng nằm rải rác.Điểm đa hình (SNP)là điểm mà tại vị trí nucleotide đó người ta phát hiện thấy sự đa dạng khi so sánh các cá thể trong quần thể. Đoạn đa hình (LSP)xuất hiện chủ yếu do đột biến mất đoạn và sắp xếp lại. 1.2.2. Phân nhánh dòng trong cấu trúc quần thể của vi khuẩn lao Tất cả các nghiên cứu đều đưa ra kết quả khá thống nhất là vi khuẩn lao có cấu trúc quần thể phân bố theo dòng. 1.2.3. Vi khuẩn lao có tính đặc trưng theo khu vực địa lý Tại mỗi khu vực địa lý khác nhau, phân bố dòng của vi khuẩn lao mang tính đặc trưng khác nhau. 1.3. Dịch tễ học phân tử bệnh lao - Ứng dụng và thành tựu 1.3.1. Khái niệm dịch tễ học phân tử bệnh lao Là một lĩnh vực xuất hiện khi kết hợp các lĩnh vực sinh học phân tử, y sinh lâm sàng, thống kê và dịch tễ làm một. Dịch tễ học phân tử sử dụng phương pháp tiếp cận đa chiều để xác định yếu tố căn nguyên, quá trình tiến triển, phát tán và phân bố của bệnh theo thời gian và không gian, xác địnhvai trò của yếu tố căn nguyên ở khía cạnh di truyền, tương tác với môi trường và vật chủ ở mức độ phân tử và xác định phân bố của yếu tố căn nguyên trong quần thể vật chủ. 1.3.2. Lịch sử phát triển của dịch tễ học phân tử bệnh lao Phân loại phân tử vi khuẩn lao được áp dụng từ những năm 90 của thế kỷ XX, lúc đầu được sử dụng để điều tra dịch và lây truyền bệnh lao trong phạm vi nhỏ,sau đó để xác định chỉ số lây và các yếu tố nguy cơ trong các nghiên cứu ở phạm vi cộng đồng và đa cộng đồng. Những ứng dụng sau đó được mở rộng bao gồm xác định nhiễm chéo phòng thí nghiệm, tỷ lệ tái phát, tái nhiễm trong số các trường hợp tái mắc lao, khả năng lây của bệnh nhân AFB âm tính, truy tìm nguồn lây, điều tra tiếp xúc, điều tra lan truyền chủng kháng thuốc, chủng độc tính cao, nghiên cứu cấu trúc quần thể, mối liên quan giữa biến đổi cấu trúc quần thể với thay đổi môi trường, khí hậu, biến động dân số và các biện pháp can thiệp, khống chế. 5 1.3.3. Ứng dụng và thành tựu trong lĩnh vực dịch tễ học phân tử bệnh lao 1.3.3.1. Quản lý bệnh lao bằng dịch tễ học phân tử:Dịch tễ học phân tử cho biết tình trạng hiện thời, dự báo được tiến triển của dịch tễ bệnh lao và cảnh báo yếu tố nguy cơ. 1.3.3.2. Xác định chỉ số lây bệnh lao:Phát hiện các dây truyền dịch tễ bằng phân tích typ phân tử vi khuẩn lao,từ đó xác định chỉ số lây bệnh. 1.3.3.3. Điều tra tiếp xúc, nguồn lây và đường lây truyền:Sự giống nhau về typ phân tửcho phép xác định các trường hợp trong cùng dây truyền dịch tễ, từ đó cho phép điều tra tiếp xúc, nguồn lây và đường lây truyền. 1.3.3.4. Điều tra khả năng lây truyền lao kháng thuốc:Khả năng lây truyền của chủng kháng thuốc có thể xác định bằngtần suất xuất hiện của chủng kháng thuốc trong cụm phân tử. 1.3.3.5. Theo dõi chủng lao gây dịch hay chủng có đặc tính đặc trưng:Sự phát tán của chủng gây dịch hay chủng có đặc tính sinh học đặc trưng có thể theo dõi bằng các marker di truyền. 1.3.3.6. Điều tra đa nhiễm vi khuẩn lao: Một bệnh nhân lao có thể bị đa nhiễm bởi hơn một chủng lao trong cùng một thời điểm. Phân tích phân tử có thể xác định sự tồn tại của đa nhiễm vi khuẩn lao 1.3.3.7. Đánh giá gánh nặng bệnh lao gây bởi tái nhiễm lao: Tái nhiễm lao là trường hợp bị nhiễm một chủng vi khuẩn lao mới sau khi đã bị nhiễm lao trước đó. Phân tích phân tử có thể xác định tái nhiễm vi khuẩn lao. 1.3.3.8. Điều tra cấu trúc quần thể vi khuẩn lao và tầm quan trọng dịch tễ của các dòng vi khuẩn lao khác nhau:Phân tích phân tử đã định danh các dòng vi khuẩn lao chính hiện đang lưu hành trên thế giới như Beijing, Haarlem, CAS, EAI, LAM, Manu, S, T, X, các dưới dòng đặc thù theo quốc gia như Manila, Delhi, VNM (Việt Nam), Northaburi, SOM (Somali), BDG (Bangladesh) v.v.. Các dòng hay dưới dòng khác nhau có vai trò và ảnh hưởng khác nhau đến tình hình và biến động dịch tễ bệnh lao tại mỗi khu vực. 1.3.3.9. Phát triển công cụ chẩn đoán:Khác nhau về di truyền trong vi khuẩn lao cần phải được cân nhắc khi lựa chọn marker phân tử hay kháng nguyên vi khuẩn sử dụng trong chẩn đoán bệnh lao.Hiệu quả chẩn đoán có thể bị ảnh hưởng bởi các đột biến và tính đa dạng của cấu trúc di truyền quần thể. 1.3.3.10. Phát triển thuốc chống lao:Phát triển thuốc mới cần phải quan tâm đến cấu trúc quần thể của vi khuẩn lao.Việc tìm hiểu xem liệu có dòng vi khuẩn lao nào có thể chứa các điểm hay đoạn đa hình trên nhiễm sắc thể gây nên tính kháng thuốc tự nhiên của vi khuẩn đóng vai tròquan trọng để đưa ra quyết định sử dụng đối với mỗi loại thuốc. 6 1.3.3.11. Phát triển vắc-xin phòng lao mới:Đánh giá hiệu quả dự phòng của vắc-xin ở mỗi khu vực phải tính đến ảnh hưởng cấu trúc quần thể vi khuẩn, khả năng sinh miễn dịch khác nhau của mỗi quần thể vật chủ. 1.4. Các kỹ thuật phân tử phân loại vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử bệnh lao 1.4.1. Kỹ thuật IS6110- RFLP Enzyme giới hạn PvuII được dùng để cắt nhiễm sắc thể vi khuẩn tại vị trí trên IS6110. Sau đó các đoạn cắt được lai với đoạn mồi có đánh dấu mang trình tự bổ sung.Sau khi lai, tất cả các đoạn có mang trình tự bổ sung với đoạn mồi sẽ được hiển thị trên film quang học, tạo nên hình vạch RFLP đặc trưng cho vi khuẩn. IS6110- RFLP được công nhận là tiêu chuẩn vàng trong phân loại vi khuẩn lao. Tuy nhiên kỹ thuậtkhá phức tạp, tốn kém, không thể sử dụng trong đáp ứng nhanh và thiếu hiệu quả trong phân loại chủng lao có ít hoặc không chứa IS6110. 1.4.2. Kỹ thuậtspoligotyping Spoligotyping dựa trên phát hiện 43 đoạn trung gian trong vùng DR. Các đoạn này được tổng hợp bằng PCR với cặp mồi Dra và Drb, trong đó Dragắn biotin.Sản phẩm PCR sau đó được lai với màng gắn 43 oligonucleotide có trình tự bổ sung với 43 đoạn trung gian. Các đoạn trung gian có mặt sẽ gắn với các oligonucleotide trên màng và được phát hiện khi bộc lộ với phim quang học.Hình vạch spoligo (psoligotype)đặc trưng cho mỗi vi khuẩnvà được sử dụng cho phân loại. Spoligotyping có lợi thế nhanh, đơn giản và cókhả năng phát hiện chủng lao dòng Beijing nhưng khả năng phân biệt nhìn chung kém hơn IS6110-RFLP. Dữ liệu spoligotyping và phân mềm phân tích bao gồmSpolDB4, SITVIT WEB,SPOTCLUST, SpolTools. 1.4.3. Kỹ thuật MIRU- VNTR Các trình tự lặp lại tại mỗi MIRU-VNTR được nhân lên và điện di trên gel agarose. Dựa trên kích thước sản phẩm, số lần lặp lại của đơn vị lặp lại tại mỗi locus được xác định. MIRU-VNTR type được thể hiện dưới dạng 12, 15 hay 24 số tự nhiên khi sử dụng bộ phân loại 12, 15 hay 24 MIRU- VNTR, mỗi số tương ứng với số lần lặp lại của một MIRU-VNTR.Trong một số trường hợp, số lần lặp lại tại mỗi MIRU-VNTR co thể lên tới 10 hoặc hơn, dẫn đến 2 số tự nhiên tương ứng với 1 MIRU-VNTR.Phân loại MIRU- VNTR cho độ phân biệtcao. MIRU-VNTR phối hợp với spoligotyping có thể thay thếphân loại chuẩn vàngIS6110-RFLP. Chương trình phân tích số liệu bao gồm: MIRU-VNTRplus,eBURST, Bionumerics và PAUP. 7 Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 5 bộ chủng lao. Bộ thứ nhất gồm 221 chủng phân lập tại 8 trung tâm chống lao quận huyện của hai tỉnh Hà Tây và Hà Nội vàtrên cộng đồng dân cư tỉnh Hưng Yên. Bộ thứ hai gồm 300 chủng thu thập ngẫu nhiên (sử dụng số đăng kýnhập viện liên tiếpcủa bệnh nhân)từ ba bệnh viện điều trị lao tuyến Trung ươngthuộc ba miền Bắc, Trung và Nam. Bộ thứ ba gồm400 chủng thu thập theo tiêu chuẩn kháng thuốc từ hai bệnh viện điều trị lao tuyến Trung ương tại hai miền Bắc và Nam. Bộ thứ tư gồm19 chủng lao trẻ em và bộ thứ năm gồm7 cặp chủng lao phân lập trước và sau 6 tháng điều trị trên cùng bệnh nhân thuộc huyện Chương Mỹ, Hà Tây. Toàn bộ chủng nghiên cứu được phân lập trong giai đoạn 2003-2009. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu được thiết kế là nghiên cứu mô tả, kết hợp phân tích sử dụng các phần mềm chuyên biệt phân tích sinh học phân tử. Các kỹ thuật sử dụng cho định dòng vi khuẩn và định typ phân tử vi khuẩn lao là spoligotyping và MIRU-VNTR. 2.2.2. Cỡ mẫu Công thức tính cỡ mẫu được áp dụng cho dự đoán tỷ lệchủng dòng Beijing trong quần thể(là dòng vi khuẩn lao đóng vai trò quan trọng trong dịch tễ học phân tử bệnh lao tại Việt Nam). Cỡ mẫu được áp dụng giống nhau cho mỗi mục tiêu nghiên cứu 1 và 2. n: Cỡ mẫu tối thiểu ε = 10% (Sai số tương đối ) Z(1-/2) = 1,96 (Hệ số tin cậy, với độ tin cậy 95%) P = 54% (Tỷ lệ chủng Beijing ở Việt Nam. Anh D. D., Emerg Infect Dis, 2000) Theo công thức thì cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu là 328 cho mỗi mục tiêu nghiên cứu. 2.2.4. Biến số nghiên cứu và chỉ số kết quả 2.2.4.1. Biến số nghiên cứu - Dòng vi khuẩn lao và typ spoligo dựa trên phân loại phân tử bằng kỹ thuật spoligotyping. - Typ MIRU-VNTR của vi khuẩn lao dựa trên phân loại bằng kỹ thuật MIRU-VNTR. - Công thức kháng thuốc của vi khuẩn lao dựa trên kết quả xác định tính kháng thuốc với 4 loại thuốc điều trị lao dòng một RMP,INH, SM và EMB. 8 2.2.4.1. Chỉ số kết quả kết quả * Đáp ứng mục tiêu 1:“Mô tả đặc điểm phân bố dòng, dưới dòng của vi khuẩn lao lưu hành tại một số tỉnh khu vực đồng bằng Bắc bộ và vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2003-2009.” - Phân bố dòng, dưới dòng trong quần thể chủng vi khuẩn lao. - Mối liên quan giữa tỷ lệ chủng thuộc các dòng, dưới dòng vi khuẩn lao khác nhau với các yếu tố dịch tễ,nhằm phát hiện yếu tố ảnh hưởng đến sự lan truyền của các dòng, dưới dòng lao khácnhau. - Mối liên quan giữa tỷ lệ tạo cụm phân tử với các yếu tố dịch tễ, nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng đến sự lan truyền bệnh lao. - Tỷ lệ tạo cụm của các dòng vi khuẩn lao khác nhau dưới ảnh hưởng của các yếu tố dịch tễ, nhằm xác định khả năng lây truyền của các dòng, dưới dòng vi khuẩn lao khác nhau. - Các trường hợp tái nhiễm lao. * Đáp ứng mục tiêu 2:“Xác định mức độ kháng thuốc của các dòng, xác định phân bố dòng của quần thể theo mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập tại bệnh viện tuyến trung ương, giai đoạn 2005-2008.” - Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao theo dòngdưới ảnh hưởng của các yếu tố dịch tễ, nhằm phát hiện dòng có khả năng kháng thuốc mạnh và yếu tố nguy cơ gây ra tính kháng thuốc. - Phân bố dòng và cấu trúc