Tóm tắt Luận án Nghiên cứu bệnh vàng rụng lá cao su corynespora cassiicola (berk. & curtis) wei và biện pháp quản lý tổng hợp tại Bình Phước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG RỤNG LÁ CAO SU Corynespora cassiicola (Berk. & Curtis) Wei VÀ BIỆN PHÁP QUẢN LÝ TỔNG HỢP TẠI BÌNH PHƢỚC Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9. 62. 01. 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, NĂM 2018 Công trình đƣợc hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1. TS. Ngô Vĩnh Viễn 2. PGS.TS. Nguyễn Xuân Hồng Phản biện 1:.................................................................................................. Phản biện 2: ................................................................................................. Phản biện 3: Luận án tiến sĩ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Thƣ viện quốc gia Việt Nam 2. Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 3. Thƣ viện Viện Bảo vệ thực vật 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây cao su (Hevea brasiliensis Mull-Arg) là cây trồng đa mục đích, có vai trò rất lớn về mặt kinh tế, bảo vệ môi trường và an ninh quốc phòng. Diện tích cao su nước ta ngày càng tăng, là một trong 10 mặt hàng xuất khẩu chủ yếu. Theo Tập đoàn Cao su Việt Nam (2015), diện tích đến năm 2015 đạt 981,0 nghìn ha, tăng gấp đôi so với năm 2000. Việt nam đứng thứ 1 thế giới về năng suất (1.695 kg/ha), thứ 5 về sản lượng (1.017.000 tấn) và thứ 4 thế giới về xuất khẩu (1,14 triệu tấn) (ANRPC, 2015). Bệnh vàng rụng lá cao su là một trong những đối tượng bệnh hại quan trọng trên cây cao su. Nấm gây bệnh quanh năm ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng của cây, không những chỉ gây bệnh trên lá mà nấm còn gây bệnh trên cả cuống lá và chồi. Vết bệnh trên lá là những đốm có hình tròn, màu xám đến xám nâu, xung quanh vết bệnh có viền vàng, tại trung tâm vết bệnh đôi khi hình thành lỗ thủng hoặc vết bệnh là những sọc màu đen có hình xương cá dọc theo gân lá. Nấm gây hại cho cây cao su từ vườn ươm, nhân đến vườn kiến thiết cơ bản và vườn cây khai thác. Bệnh vàng rụng lá cao su bắt đầu xuất hiện ở Bình Phước vào khoảng đầu tháng 6 năm 2010, sau đó bệnh phát triển lây lan rộng với diện tích bị nhiễm lúc cao điểm là 8.024 ha. Bệnh gây hại làm vườn cao su bị rụng lá, sinh trưởng phát triển kém, năng suất mủ giảm, đối với cây bị nhiễm bệnh nặng có thể gây chết cây đặc biệt là trong thời kì vườn ươm và kiến thiết cơ bản. Những nghiên cứu bước đầu về bệnh này ở Việt Nam đã được tiến hành, nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu sâu và thực hiện một cách có hệ thống về đặc điểm sinh học, sự tồn tại, lây lan và biện pháp phòng trừ. Đề tài “Nghiên cứu bệnh vàng rụng lá cao su Corynespora cassiicola (Bert. & Curt.) Wei và biện pháp quản lý tổng hợp tại Bình Phước” được thực hiện nhằm xây dựng cơ sở khoa học để đề xuất các biện pháp quản lý có hiệu quả bệnh vàng rụng lá cao su, góp phần phát triển ngành cao su bền vững. 2. Mục đích, yêu cầu của đề tài 2.1. Mục đích Xác định được nguyên nhân, đặc điểm sinh học, sinh thái và các yếu tố ảnh hưởng đến sự lan truyền bệnh vàng rụng lá cao su làm cơ sở khoa học xây dựng các giải pháp phòng chống có hiệu quả cho cây cao su tại Bình Phước. 2.2. Yêu cầu - Xác định được nguyên nhân gây bệnh vàng rụng lá cao su tại Bình Phước - Xác định được đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm gây bệnh vàng rụng lá cao su tại Bình Phước, các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh và gây hại của bệnh vàng rụng lá cao su. - Đề xuất các biện pháp phòng chống bệnh có hiệu quả và thân thiện với môi trường. 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Bổ sung dẫn liệu về bệnh vàng rụng lá cao su, đặc điểm sinh học, sinh thái, sự tồn tại của nấm Corynespora cassiicola và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển, gây hại của bệnh trong điều kiện tự nhiên làm cơ sở khoa học cho việc đề xuất các giải pháp phòng chống bệnh có hiệu quả. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài đã khẳng định được nguyên nhân gây bệnh vàng rụng lá cao su, đồng thời làm sáng tỏ sự gây bệnh của nấm C. cassiicola hại cao su trong điều kiện sản xuất. Đề tài đã đề xuất quy trình tổng hợp phòng chống bệnh có hiệu quả và an toàn môi trường, góp phần phát triển bền vững ngành trồng cao su tại Bình Phước. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu - Nấm Corynespora cassiicola - Bệnh vàng rụng lá cao su 4.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu xác định nguyên nhân gây bệnh vàng rụng lá cao su tại Bình Phước, đặc điểm sinh học, tính gây bệnh, phổ ký chủ của nấm C. cassiicola. Nghiên cứu quy luật phát sinh gây hại của bệnh tại Bình Phước và đề xuất quy trình quản lý bệnh tổng hợp. 5. Những đóng góp mới của luận án - Bổ sung dẫn liệu khoa học mới về triệu chứng, đặc điểm sinh học, sự tồn tại của nấm C. cassiicola trên tàn dư lá bệnh và quá trình xâm nhiễm gây bệnh của nấm trên lá cao su. - Xác định được hậu bào tử của nấm C. cassiicola trong điều kiện in vitro. Xác định được thêm 12 cây trồng là ký chủ của nấm trong điều kiện tự nhiên trong đó có cây sắn là cây trồng xen phổ biến trên vườn cao su tiểu điền. - Bổ sung thông tin về diễn biến và các yếu tố ảnh hưởng tới phát sinh phát triển của bệnh vàng rụng lá cao su trên đồng ruộng. - Xác định một số chủng vi sinh vật đối kháng nấm C. cassiicola và sử dụng chúng để xử lý nguồn bệnh trên đồng ruộng. - Chỉ rõ thời điểm xử lý bệnh và hiệu quả hạn chế bệnh của các biện pháp phòng trừ, xây dựng và ứng dụng thành công quy trình quản lý tổng hợp bệnh vàng rụng lá trên cây cao su. 6. Cấu trúc luận án Luận án gồm 156 trang, gồm phần mở đầu 4 trang; Chương 1. Cơ sở khoa học và tổng quan tài liệu (37 trang); Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu (23 trang); Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận (75 trang); Kết luận và kiến nghị 2 trang với 40 bảng số liệu, 32 hình. Tham khảo 136 tài liệu, trong đó có 24 tài liệu tiếng việt, 112 tài liệu tiếng anh. 3 CHƢƠNG 1 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài Bệnh vàng rụng lá cao su là bệnh hại quan trọng trên cây cao su ở các vùng trên thế giới. Triệu chứng bệnh biểu hiện với mức độ khác nhau tùy thuộc vào giống, nguồn gốc cây giống cũng như các biện pháp canh tác, bảo vệ vườn cây. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ rõ bệnh vàng rụng lá cao su có khả năng lây lan nhanh và mức độ gây hại nặng nếu sử dụng cây giống đã nhiễm bệnh, cây giống mẫn cảm, kỹ thuật canh tác không được quan tâm (Chee, 1988, Fernando, 2010; Jill, 2016; Manju, 2011).. Ở nước ta, mặc dù đã có một số nghiên cứu về triệu chứng, nguyên nhân gây bệnh nhưng chưa có nghiên cứu đầy đủ về diễn biến phát sinh, sự tồn tại cũng như thời điểm phòng trừ để hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra. Do vậy, trong nghiên cứu này, các nghiên cứu tập trung xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh, đặc điểm sinh học, sự tồn tại của nấm cũng như diễn biến phát sinh nhằm đề xuất các giải pháp quản lý tổng hợp bệnh vàng rụng lá có hiệu quả. 1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc 1.2.1. Triệu chứng, lịch sử phát hiện, phân bố bệnh rụng lá Corynespora cassiicola Bệnh rụng lá cao su do nấm Corynespora cassiicola gây ra đã được ghi nhận lần đầu trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (châu Phi) năm 1936 (Wei, 1950). Tới nay nấm C. cassiicola đã lan truyền và gây hại ở tất cả các nước sản xuất cao su thuộc châu Á và châu Phi, gây tổn thất lớn cho sản xuất cao su. chưa ghi nhận được tại miền nam châu Mỹ (Déon et al., 2012). Triệu chứng bệnh biểu hiện trên cao su trồng tại vườn ươm và trồng tại vườn sản xuất, gây hại trên lá, trên chồi. Triệu chứng dễ nhận thấy là các vết bệnh dạng xương cá. Khi bệnh nặng lá chuyển thành màu vàng, sau đó chuyển sang màu nâu đồng và cuối cùng lá có thể bị rụng. 1.2.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curtis) Wei. Nấm được mô tả đầu tiên bởi Berk. & Curtis 1868 với tên gọi Helminthosporium cassiicola, tới năm 1950 nấm được gọi là Corynespora cassiicola (Berk.& Curtis) Wei. Nuôi cấy trên môi trường, tản nấm phát triển có dạng hơi xốp, màu sắc tản nấm biến thiên từ màu xanh hơi vàng đến màu xám. Sợi nấm phân nhánh và có vách ngăn với bào tử phân sinh hình thành ở đầu sợi nấm. Hình dáng bào tử từ thẳng, cong, hình trụ. Bào tử nảy mầm sinh ra một hoặc vài ống mầm giữa các vách ngăn, nhưng thường thì ống mầm mọc ra từ tế bào cuối của bào tử (Chee, 1988; Peiris et al., 2015) Nấm có thể tồn tại tới 2 năm trên tàn dư cây trồng. Phổ kí chủ rộng của loài nấm này cũng tạo điều kiện cho sự sống sót của nấm. Nấm C. cassiicola có khả năng lây nhiễm chéo rất cao (Peiris et al., 2015). 4 Rất ít nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của hậu bào tử nấm C. cassiicola. Ricardo (2012) đã ghi nhận 6 mẫu tạo ra hậu bào tử trong cả hai điều kiện in vitro và in vivo trong tổng số 15 mẫu phân lập nấm C. cassiicola trên nhiều cây trồng như: Nghệ tây, sơ ri, bí xanh, đậu tương, cà chua, đu đủ, hoa ngũ sắc, xà lách Hậu bào tử được hình thành theo 3 cách: phần cuối sợi nấm (terminal), xen vào giữa sợi nấm (intercalary) và tạo dạng hình chuỗi (chain) với 5 hậu bào tử. Hình 1.3. Hậu bào tử tạo ra trong điều kiện in vitro và in vivo. A. tạo ra từ đầu sợi nấm; B và C. Tạo ra từ giữa sợi nấm; D. Tạo hình chuỗi (Nguồn: Ricardo, năm 2012) 1.2.3. Nghiên cứu về các yếu tố sinh thái ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh trên đồng ruộng Các yếu tố môi trường như ẩm độ cao, nhiệt độ từ 28-30°C, trời nhiều mây với lượng mưa trung bình thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử nấm C. cassiicola. Sự phóng thích bào tử bắt đầu vào lúc 8 giờ sáng và đạt đỉnh cao vào 12h trưa, vào ban đêm bào tử phóng thích ít hoặc không có sự phát tán. Triệu chứng bệnh phát triển có liên quan đến lượng mưa, nhiệt độ và độ ẩm (Purwantara and Pawirosoemardjo, 1991). Cao su trồng ở vùng thấp bị bệnh nặng hơn (Situmorang et al., 1984). 1.2.4. Những nghiên cứu về các biện pháp quản lý tổng hợp bệnh vàng rụng lá cao su Sử dụng các dòng cao su kháng bệnh, cũng như trồng nhiều dòng hoặc đa dòng ở những vùng có nguy cơ lây bệnh cao (Ho et al., 1974). Tại các vườn cao su thiếu dinh dưỡng, hệ vi sinh vật đất suy giảm, nấm C. cassiicola có điều kiện phát triển gây bệnh và phát tán rất nhanh trong mùa mưa khi ẩm độ của không khí bão hoà. Bón đủ phân hữu cơ và NPK cho vườn cao su sẽ hạn chế bệnh phát triển (Liyanage, 1987). Manju (2011a) cho biết Trichoderma viride ức chế sự phát triển của nấm trong điều kiện invitro và ngoài đồng ruộng. T. harzianum, Bacillus subtilis và Pseudomonas fluorescens có hiệu quả ức chế nấm trong điều kiện invitro, chưa ghi nhận hiệu quả ở điều kiện đồng ruộng. 5 Jill (2016) cho biết khi sử dụng các hoạt chất: Propineb, Chlorothalonil và Copper hydroxide phun 4 lần (1 tuần/lần) trong điều kiện vườn ươm có hiệu quả giảm bệnh từ 92,51% tới 98,08%. Đối với cây cao su ở vườn sản xuất cần tiến hành phun thuốc ngay từ khi bệnh mới xuất hiện. Các loại thuốc như Mancozeb 0,2%, Carbenzim 0,05% hoặc Boocdo 1% trong giai đoạn rụng lá sẽ cho hiệu quả phòng trừ bệnh (Manju, 2011; Fernaldo, 2012). 1.3. Một số nghiên cứu trong nƣớc 1.3.1. Triệu chứng, phân bố của bệnh vàng rụng lá cao su Bệnh vàng rụng lá cây cao su phát hiện lần đầu ở Việt Nam vào tháng 8 năm 1999 tại Trạm Thực Nghiệm cao su Lai Khê thuộc Viện Nghiên cứu cao su Việt Nam. Từ cuối 2009 đến giữa năm 2010 do điều kiện thời tiết thuận lợi, mưa nhiều, bệnh vàng rụng lá đã phát sinh và gây hại trên diện tích lớn vườn cây cao su tại vùng Đông Nam Bộ và một số vùng Tây Nguyên. Nấm đã tấn công cả trên lá già, lá non, chồi non gây vàng rụng lá ảnh hưởng đến sinh trưởng và sản lượng mủ của vườn cây cao su (Phan Thành Dũng, 2010). 1.4.2.3. Đặc điểm sinh học, sinh thái học của nấm C. cassiicola Tác giả Lê Thị An Nhiên (2016), Nguyễn Thị Thu Thủy (2016) đã nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh thái nấm C. cassiicola gây bệnh vàng rụng lá cao su. 1.3.1.2. Nghiên cứu về biện pháp phòng trừ Từ tháng 10 năm 2000 trở về trước, nấm C. cassiicola gây ra được xếp vào danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật ở Việt Nam, các biện pháp xử lý đối với bệnh trong thời gian này phải tuân thủ quy định của pháp luật về bảo vệ và kiểm dịch thực vật của Việt Nam, cũng như phải phù hợp với Quy định của Công ước quốc tế về bảo vệ thực vật. Trần Ánh Pha và cs. (2013) đã thu thập được 24 nguồn nấm Trichoderma trên lá cao su khô, thân cây cao su, đất vườn cao su, rễ cây cao su, có khả năng đối kháng với bệnh trên chồi non và lá cao su do nấm Corynespora cassiicola. Đỗ Thị Thanh Dung (2015) đã chọn được 3 chủng BD1N1, ĐN9N2, ĐN5N1 thuộc chủng Trichoderma sp. có khả năng đối kháng mạnh với nấm C.cassiicola và có tiềm năng ứng dụng làm chế phẩm vi sinh giúp phòng và trị bệnh Corynespora trên cây cao su. Nguyễn Văn Minh (2014) đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn nội sinh và đã xác định chủng T9 và T16 có kết quả đối kháng với nấm Corynespora cassiicola, ức chế 100% ở nồng độ 1:1. Các loại thuốc trừ nấm chứa hoạt chất Hexaconazole nồng độ 0,15% hoặc Carbendazim (Carbenzim 500FL, Carbenvil 50SC, Carban 50SC,.), hay hỗn hợp của Hexaconazole và Carbendazim phối trộn theo tỷ lệ 1:1, Arivit 250SC. Vixazol 275SC nồng độ 0,2-0,3% có hiệu quả cao khi sử dụng để phòng trừ nấm C.cassiicola (Trần Huy Bình, 2013; Phan Thành Dũng và cs, 2010). Một số tồn tại về nghiên cứu và phòng trừ bệnh vàng rụng lá cao su tại Bình Phước và hướng giải quyết của đề tài - Từ những kết quả trong phần tổng quan ở Việt Nam cho thấy từ những năm 2012 trở về trước khi đề tài thực hiện đã có một số công trình công bố về triệu chứng 6 bệnh nhưng chưa có nhiều tài liệu trong nước công bố về sự tồn tại của nấm, các yếu tố ảnh hưởng đến lan truyền bệnh trên đồng ruộng, bộ thuốc hóa học và thời điểm thử nghiệm có hiệu quả. Chưa có công trình nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh này trên đồng ruộng. - Chưa có tài liệu nào công bố về quá trình xâm nhiễm của nấm C. cassiicola trên lá cao su cũng như thời điểm phun thuốc hóa học và các biện pháp khác phòng trừ có hiệu quả. - Bệnh vàng rụng lá (VRL) là bệnh mới và lần đầu gây hại trên diện rộng, người dân còn chủ quan và lúng túng trong biện pháp phòng trừ. Trong khi đó bệnh VRL cao su lại lây nhiễm gây hại ở các bộ phận non của cây phía trên ngọn và các đầu cành. Trong khi đó hiện nay còn thiếu dụng cụ chuyên dùng để phun ướt đều tán lá vì vậy hiệu quả phun thuốc hóa học phòng trừ bệnh còn thấp. Do vậy, đề tài được xây dựng với mục tiêu cụ thể là xác định được nguyên nhân, đặc điểm sinh học, sinh thái và các yếu tố ảnh hưởng đến sự lan truyền, phát sinh và gây hại của bệnh VRL cao su, làm cơ sở khoa học đề xuất quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh có hiệu quả. CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu + Xác định nguyên nhân gây bệnh vàng rụng lá cao su tại Bình Phước. + Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm C. cassiicola gây bệnh vàng rụng lá cao su. + Nghiên cứu diễn biến, ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái (giống, tuổi cây, đất đai.) đến sự phát sinh và phát triển của bệnh vàng rụng lá cao su. + Nghiên cứu các biện pháp quản lý tổng hợp bệnh vàng rụng lá cao su tại Bình Phước. 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh cây – Viện Bảo vệ thực vật, Bắc Từ Liêm, Hà Nội. - Các vườn trồng cao su trên địa bàn các xã thuộc huyện Chơn Thành, Lộc Ninh, Đồng Phú, Đồng Xoài, Bù Gia Mập của tỉnh Bình Phước. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2012 - 8/2016 2.2. Vật liệu nghiên cứu: - Mẫu triệu chứng bệnh vàng rụng lá, mẫu đất, mẫu rễ cây cao su. - Các nguồn nấm C. cassiicola phân lập trên giống cao su RRIV4, PB 260 và một số cây ký chủ như sắn, cà chua, đậu tương.. - Các chủng vi sinh vật đối kháng TS1, TS2, LH và G2.8 ( Bacillus sp.), B. Subtilis, Steptomycetes Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, Trichoderma sp. - Các môi trường nghiên cứu nấm như môi trường PDA (Potato Dextrose agar), PSA (Potato Sucrose agar), CMA (Corn meal agar), CA (Carot agar), Czapek’s agar, King’s B, TSA, V8, YES, WA (water agar). - Các cặp mồi ITS4 và ITS5 7 - Chế phẩm nấm Trichoderma (109 bào tử/gr). Chế phẩm đóng gói 1kg, chủng nấm Trichoderma harzianum. Các hoạt chất BVTV: Carbendazim 500g/l; Hexaconazole 50g/l; Tebuconazole 430g/l; Difeconazole 250g/l; Propiconazole 250g/l; Thiophanate methyl; Chlorothalonil 75%; Mancozeb 80%; Propineb 80%; Zineb 80%; Copper oxychloride 80%. - Các giống cao su : RRIV 4, PB 260, GT 1, LH 90/952.. . - Máy PCR, máy điện di, kính hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp, các dụng cụ và vật liệu thí nghiệm, cần thiết khác. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Xác định nguyên nhân gây bệnh vàng rụng lá cao su 2.4.1.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu: theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, Viện Bảo vệ thực vật, 1997. 2.4.1.2. Phương pháp phân lập mẫu Phân lập và làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử của Burgess và ctv. (2009). 2.4.1.3. Lây bệnh nhân tạo trong nhà lưới theo quy trình Koch’s. Tạo nguồn nấm theo phương pháp của Chee (1988). Phun dịch bào tử có bổ sung Tween 20 (1 giọt/100ml) lên cả hai mặt lá. Giữ cây cao su trong điều kiện 28°C, độ ẩm 100% trong 48h sau đó nuôi trong điều kiện nhà kính, 28°C. 2.4.1.4. Phương pháp xác định nấm bằng hình thái theo khóa phân loại của Ellis and Holiday (1971). 2.4.1.5. Xác định tác nhân bằng giải trình tự gen Trình tự các cặp mồi đã sử dụng ITS4 (White et al, 1990) 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ITS5 (White et al., 1990) 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ - Giải trình tự và phân tích trình tự: Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phân tích trình tự được thực hiện dùng các phầm mềm ClustalX và MEGA5.1. 2.4.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm C. cassiicola gây bệnh vàng rụng lá cao su 2.4.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm - Nấm bệnh được phân lập và nuôi cấy trên môi trường PDA trong điều kiện 28°C, chế độ sáng tối xen kẽ sau 12 h. - Quan sát màu sắc tản nấm, hình dạng, kích thước bào tử, cành bào tử. - Đo kích thước bào tử trên kính hiển vi quang học. 2.4.2.2. Nghiên cứu các yếu tố sinh thái ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm C. cassiicola Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, điều kiện chiếu sáng, điều kiện pH đến sự phát triển của nấm theo phương pháp nghiên cứu BVTV. 8 2.4.2.3. Nghiên cứu về tính gây bệnh của nấm C. cassiicola + Nghiên cứu khả năng nảy mầm của bào tử nấm trên môi trường Các mẫu nấm C. cassiicola được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28 0C, sau 7 ngày thu bào tử và hiệu chỉnh dung dịch để đạt số lượng bào tử 105/ml. Đếm số bào tử nảy mầm trên 100 bào tử quan sát sau 0,75 h; 1,5 h; 3 h; 4,5 h; 6 h và 7,5 h. + Nghiên cứu tính gây bệnh của nấm C. cassiicola trên các tuổi lá cao su khác nhau. Theo phương pháp của Fernando, 2010b. + Nghiên cứu quá trình xâm nhiễm của nấm C. cassiicola trên lá cao su Chuẩn bị lá cao su 10 ngày tuổi. Tạo vết thương nhẹ cạnh gân lá. Lây nhiễm nhân tạo nấm C.cassiicola 105 bào tử/ml lên lá cao su non rồi đặt trong hộp nhựa ẩm độ 100% trong 28oC. Mỗi lá nhỏ 4 giọt dung dịch nấm dọc theo gân lá (20µl). Lá đối chứng được nhỏ nước lã. Tiến hành thí nghiệm trên 5 lá. Dùng lam cắt mỏng lá sau đó nhuộm bằng cotton blue. Xác định các cấu trúc sợi nấm, bào tử, bào tử nảy mầm trong mô lá dưới kính hiển vi quang học sau mỗi 2 h đến khi bào tử nảy mầm. 2.4.2.4. Nghiên cứu sự tồn tại của nấm C. cassiicola