Tóm tắt luận án Nghiên cứu căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em dưới 5 tuổi tại Nha Trang, năm 2009

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG VŨ VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU CĂN NGUYÊN GÂY NHIỄM TRÙNG HÔ HẤP CẤP TÍNH Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI TẠI NHA TRANG, NĂM 2009 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 62.72.01.15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2012 2 Công trình được hoàn thành tại: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. ĐẶNG ĐỨC ANH 2. PGS.TS. PHAN LÊ THANH HƯƠNG Phản biện 1: PGS.TS. Lê Thị Oanh-Trường Đại học Y Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS. Lê Thị Luân-Trung tâm Khoa học Sản xuất vắc xin Sabin Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung-Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện tổ chức tại: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2012 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia. - Thư viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. 3 BẢNG NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT cDNA Complimentary deoxiribonucleotid acid CFU Colony Forming Unit (Đơn vị dạng khuẩn lạc) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch tìm enzyme) H. influenzae Haemophilus influenzae M. catarrhalis Moraxella catarrhalis MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) PBP Penicillin Binding Protein (Penicillin kết hợp với protein) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi khuyếch đại gen) RSV Respiratory Syncytial Virus (Vi rút hợp bào hô hấp) RT-PCR Reveser Transcriptation - Polymerase Chain Reaction (Phiên mã ngược) S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae (Phế cầu) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm trùng hô hấp cấp (NTHHC) là nhóm bệnh rất phổ biến ở trẻ em các nước đang phát triển và cả các nước đã phát triển. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 15 triệu trẻ em chết trên toàn thế giới, trong đó 95% ở các nước đang phát triển, thì có tới 4 triệu trẻ chết vì NTHHC. Do vậy, WHO coi việc xác định và phòng chống căn nguyên gây NTHHC là một trong những chiến lược mang tính nền tảng, nhằm nâng cao sức khoẻ trẻ em. Ở Việt Nam, NTHHC hiện đang có tỷ lệ mắc và tử vong cao, đứng đầu trong nhóm bệnh nhiễm trùng cấp tính. Căn nguyên gây NTHHC rất đa dạng: do vi khuẩn, vi rút hoặc ký sinh vật. Đối với các nước phát triển, căn nguyên gây bệnh chủ yếu do vi rút, chiếm 80 - 90%; các vi rút gây bệnh hay gặp là cúm, hợp bào đường hô hấp, Rhinovirus và Adenovirus. Ở các nước đang phát triển, căn nguyên gây bệnh lại chủ yếu do vi khuẩn chiếm 75%; các vi khuẩn gây bệnh hay gặp là S. pneumoniae, H. influenzae và M. catarrhalis. Đây là những vi khuẩn thuộc hệ vi khuẩn bình thường và gây bệnh có điều kiện, nên khi tìm thấy chúng vẫn chưa khẳng định chắc chắn đó là tác nhân gây bệnh. Vì vậy, tìm ra giới hạn nền để biết được đó là vi khuẩn thuộc hệ vi khuẩn bình thường hay tác nhân của bệnh là rất cần thiết. WHO đã rất nỗ lực trong việc phòng chống NTHHC ở phạm vi toàn cầu, nhưng tỷ lệ mắc và tử vong giảm chậm, do vi khuẩn thay đổi tính kháng kháng sinh, hạn chế hiệu quả điều trị. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện luận án: "Nghiên cứu căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em dưới 5 tuổi tại Nha Trang, năm 2009". MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Xác định giới hạn nền một số căn nguyên gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi. 2. Xác định căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi và tính nhạy cảm với kháng sinh của các vi khuẩn thường gặp. 3. Tìm hiểu một số yếu tố liên quan đến căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi. CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Nêu ra được giới hạn nền về mật độ vi khuẩn có trong bệnh phẩm họng mũi, làm cơ sở cho việc phân tích, đánh giá kết quả xét nghiệm chẩn đoán nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính ở trẻ em. 2. Xác định được sự phân bố tỷ lệ vi khuẩn, vi rút có khả năng gây bệnh ở trẻ lành và trẻ dưới 5 tuổi mắc nhiễm trùng hô hấp cấp tính. 3. Cập nhật được thông tin về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của một số vi khuẩn gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính ở trẻ em và cho biết một số yếu tố liên quan đến nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em. 2 CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án dày 125 trang không kể phần tài liệu tham khảo và phụ lục; gồm 4 chương, 38 bảng, 10 biểu đồ, 3 hình; 125 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước. Bố cục luận án gồm: đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 35 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 26 trang, kết quả 31 trang, bàn luận 28 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang; 2 bài báo có liên quan đến luận án đã được công bố. Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm giải phẫu, sinh lý, miễn dịch bộ máy hô hấp và hệ vi khuẩn bình thường ở trẻ em 1.1.1. Đặc điểm về giải phẫu: Bộ máy hô hấp được hình thành từ ngày thứ 20 - 22 của thời kỳ phôi thai; tiếp tục phát triển về cấu tạo, chức năng cho đến khi trẻ ra đời và bộ máy hô hấp hoạt động được. Nhưng về mặt cấu tạo và chức năng chưa hoàn chỉnh; nên bộ máy hô hấp của trẻ còn tiếp tục phát triển đến tuổi trưởng thành. 1.1.2. Đặc điểm về sinh lý: Các đường dẫn khí ngắn, nhiễm trùng đường hô hấp trên dễ lan xuống đường hô hấp dưới. Sức cản đường hô hấp rất lớn, sự giãn nở của lồng ngực kém. Bệnh lý đường hô hấp do niêm mạc có nhiều mạch máu; nên dễ bị xung huyết, phù nề, xuất tiết càng làm hẹp đường thở; nên sức cản tăng lên, gây rối loạn thông khí. 1.1.3. Cơ chế miễn dịch bảo vệ đường hô hấp trẻ em: Vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp, chúng gặp phải hệ thống bảo vệ đường hô hấp gồm: hàng rào niêm mạc, các yếu tố thể dịch và các tế bào thực bào. 1.1.4. Hệ vi khuẩn bình thường ở trẻ em: - Vi khuẩn ở mũi: ở mũi có các vi khuẩn giả bạch hầu và tụ cầu, trong đó đáng chú ý là tụ cầu vàng. Có tới 20-50% người lành mang tụ cầu vàng trong mũi và tỷ lệ này cao hơn ở những người làm việc trong môi trường bệnh viện. - Vi khuẩn ở họng mũi: ở họng số lượng và chủng loại vi khuẩn khá phong phú do từ miệng lan truyền như phế cầu, H. influenzae, M. catarhalis, S. viridans. Tuy vậy, tuỳ vị trí mà vi khuẩn có khả năng gây bệnh, đặc biệt ở tuyến hạnh nhân thường có liên cầu nhóm A thường gây viêm họng và bệnh thấp tim. - Vi khuẩn ở khí quản và phế quản: do đặc điểm cấu tạo, sinh lý có chất niêm dịch, đại thực bào nên ở đường hô hấp dưới thường không có vi khuẩn. 3 1.2. Căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi và tính nhạy cảm với kháng sinh 1.2.1. Tình hình nghiên cứu NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi: 1.2.1.1. Nghiên cứu NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi trên thế giới: NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi, chiếm vị trí hàng đầu về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trên toàn thế giới. Tỷ lệ tử vong do NTHHC ở các nước đang phát triển cao gấp 30 - 50 lần ở các nước phát triển. Các nghiên cứu cho thấy: ở các nước phát triển, căn nguyên gây NTHHC chủ yếu do vi rút chiếm 80 - 90%. Còn ở các nước đang phát triển, căn nguyên lại chủ yếu do vi khuẩn chiếm 75%. 1.2.1.2. Nghiên cứu NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi tại Việt Nam: Việt Nam NTHHC hiện có tỷ lệ mắc và tử vong cao chủ yếu ở trẻ dưới 5 tuổi. Theo báo cáo của chương trình quốc gia, phòng chống NTHHC năm 2000: tỷ lệ mắc NTHHC của trẻ em nước ta là 65,8%, chiếm tỷ lệ cao nhất trong các bệnh mắc phải ở cộng đồng. 1.2.2. Căn nguyên vi rút gây NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi: 1.2.2.1. Vi rút cúm: Vai trò gây bệnh: vi rút cúm lây truyền từ người sang người qua đường hô hấp. Triệu chứng lâm sàng hay gặp: sốt nhẹ, hắt hơi, đau đầu, ho, xuất tiết nhiều. Ở trẻ nhỏ bệnh có biểu hiện với các triệu chứng: sốt cao, co giật, viêm dạ dày - ruột. Bệnh ở trẻ sơ sinh còn nặng hơn với các triệu chứng: viêm cơ tim, viêm phổi và có thể đưa đến biến chứng viêm não, dẫn tới tử vong. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: - Cách lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm cần được lấy trong giai đoạn sớm khi bệnh mới khởi phát. Bệnh phẩm tốt nhất cho chẩn đoán cúm là bệnh phẩm họng mũi, kết hợp với bệnh phẩm họng miệng. - Bệnh phẩm cho chẩn đoán huyết thanh: máu ở giai đoạn cấp tính được thu nhận càng sớm càng tốt. Máu ở giai đoạn hồi phục được lấy sau 14-28 ngày kể từ khi lấy máu cấp tính. Huyết thanh được bảo quản ở -200C cho tới khi làm xét nghiệm. - Phương pháp chẩn đoán: + Phân lập và định loại vi rút: bệnh phẩm trong môi trường vận chuyển cấy vào khoang ối của phôi gà 9 ngày tuổi, ủ 48 giờ ở 330C, ủ ở 40C qua đêm, thu dịch ối, xác định hiệu giá HA, nếu dương tính thì làm HI để xác định týp và phân týp. + Phát hiện vật liệu di truyền của vi rút: vật liệu di truyền của vi rút là ARN sợi âm. Kỹ thuật phân tử được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vật liệu di truyền của vi rút cúm là RT-PCR. + Các kỹ thuật miễn dịch được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh và nghiên cứu cúm: phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu, kỹ thuật ELISA... 4 1.2.2.2. Vi rút hợp bào đường hô hấp: Vai trò gây bệnh: RSV lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt chất tiết có vi rút. Bệnh thường gặp ở trẻ từ 6 tuần đến 6 tháng tuổi. Khởi phát với các dấu hiệu của viêm đường hô hấp trên: sốt, ho, chảy mũi. Ở trẻ lớn, nhiễm RSV thường có bệnh cảnh của nhiễm lạnh hoặc rất ít triệu chứng; do vậy, chẩn đoán lâm sàng gặp rất nhiều khó khăn. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: bệnh phẩm là dịch họng mũi nuôi cấy trong tế bào cảm thụ để tìm tế bào khổng lồ. Ngoài ra, chẩn đoán xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, PCR. 1.2.2.3. Adenovirus: Vai trò gây bệnh: vi rút gây ra nhiễm trùng cấp tính với đặc điểm: thời gian ủ bệnh ngắn, đào thải vi rút kéo dài, bệnh thường nhẹ, nhưng viêm phổi ở trẻ nhỏ có thể gây tử vong. Vi rút không nhân lên mà tồn tại lâu dài trong tế bào, khi sức đề kháng cơ thể giảm mới nhân lên và gây bệnh. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: sử dụng tế bào Hep 2 là tế bào cảm thụ đặc hiệu với Adenovirus. Các phiến nhựa nuôi cấy tế bào Hep 2, đã được gây nhiễm bằng bệnh phẩm, nếu thấy hủy hoại tế bào trên 25%, tiến hành kỹ thuật PCR hoặc miễn dịch huỳnh quang để xác định Adenovirus. 1.2.2.4. Rhinovirus: Vai trò gây bệnh: Rhinovirus xâm nhập vào cơ thể do hít phải những hạt dịch tiết đường hô hấp của người bệnh hoặc gián tiếp qua bàn tay, khăn tay, đồ dùng, đồ chơi trẻ em bị nhiễm dịch tiết đường hô hấp có chứa vi rút. Vi rút xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp trên và thường chỉ giới hạn gây bệnh ở đây. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: chẩn đoán phòng thí nghiệm dựa vào phân lập vi rút từ dịch tiết họng mũi, trên nuôi cấy tế bào. Sử dụng kỹ thuật PCR để xác định gen đặc hiệu của vi rút. 1.2.3. Căn nguyên vi khuẩn gây NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi: 1.2.3.1. Phế cầu (S. pneumoniae): Vai trò gây bệnh: S. pneumoniae thường cư trú ở vùng tỵ hầu của người lành, với tỷ lệ cao từ 40 đến 70%; vi khuẩn có thể gây viêm đường hô hấp, điển hình là viêm phổi. Viêm phổi do S. pneumoniae xảy ra sau khi đường hô hấp bị tổn thương do nhiễm vi rút hoặc hoá chất. S. pneumoniae còn gây viêm tai, viêm xoang, viêm họng; nhiễm khuẩn huyết và gây viêm màng não ở trẻ em. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: * Nhuộm Gram: bệnh phẩm họng mũi ít có giá trị xác định căn nguyên gây bệnh; vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và nếu xác định được vi khuẩn, có thể đó là vi khuẩn thuộc hệ vi khuẩn bình thường. 5 * Nuôi cấy phân lập: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới. Tiêu chuẩn xác định phế cầu: - Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 5%: nhỏ, ướt, có xu hướng lõm giữa, tan huyết alpha. - Tính chất vi khuẩn: Song cầu hình ngọn nến hay cặp mắt kính, bắt màu Gram (+) và nhạy cảm optochin (đường kính vòng vô khuẩn ≥14mm) hoặc ít nhạy cảm optochin, nhưng tan trong muối mật. Không phải là phế cầu khuẩn khi: - Không nhạy cảm với optochin - Hoặc có vùng ức chế phát triển bởi optochin với đường kính < 14mm, không tan trong muối mật. 1.2.3.2. H. influenzae: Vai trò gây bệnh: H. influenzae ký sinh bắt buộc ở niêm mạc đường hô hấp của người; khoảng 75% trẻ lành có mang H. influenzae ở họng mũi như là một thành viên của hệ vi khuẩn bình thường; người lớn thì tỷ lệ này thấp hơn. H. influenzae có 2 loại chính: loại có vỏ có týp huyết thanh và loại không vỏ không týp huyết thanh. Loại không vỏ thường gây nhiễm khuẩn nhẹ ở đường hô hấp trên như viêm amiđan, viêm tai giữa. Loại có vỏ gây ra các nhiễm trùng nặng như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: * Nhuộm Gram: đánh giá số lượng các tế bào viêm và vi khuẩn ở trong, ngoài tế bào theo +, ++, +++. * Nuôi cấy, phân lập: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới. Tiêu chuẩn xác định H. influenzae: - Cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu Gram (-), khuẩn lạc trong xám nhẹ, óng ánh, không gây tan huyết. - Phát triển thuần nhất trên môi trường chọn lọc. - Phát triển được cần có đủ yếu tố X và V. - Định týp sinh học với các phản ứng sinh hóa: ODC, URE và IND. - Định týp huyết thanh: chủng gây bệnh hầu hết thuộc typ b. 1.2.3.3. Moraxella catarrhalis: Vai trò gây bệnh: M. catarrhalis là một trong ba căn nguyên thường gặp gây viêm tai giữa ở trẻ em, chiếm từ 10-15%. M. catarrhalis là vi khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội cư trú ở đường hô hấp trên của trẻ khoẻ, viêm tai giữa thường xuất hiện sau khi tăng tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn từ nơi cư trú; viêm phổi bắt đầu từ nhánh phế quản nhỏ của phổi. 85% số chủng M. catarrhalis phân lập được ở Mỹ, sinh β - lactamase. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: * Nhuộm Gram: bệnh phẩm là các chất dịch, mủ, máu tuỳ từng thể nhiễm trùng. Nhuộm Gram có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán M. catarrhalis. 6 * Nuôi cấy, phân lập: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới. Tiêu chuẩn để xác định M. catarrhalis: - Song cầu bắt mầu Gram (-) - Không mọc trên Mac Conkey - Không phân giải các loại đường - ONPG (-), oxidase (+), catalase (+), DNase (+) 1.2.4. Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn gây NKHHC ở trẻ dưới 5 tuổi và các kỹ thuật xác định mức nhạy cảm với kháng sinh: 1.2.4.1. Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn gây NKHHC ở trẻ dưới 5 tuổi: Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về độ nhạy cảm với kháng sinh của các vi khuẩn gây NKHHC, nhất là kháng sinh khuyến cáo trong điều trị NKHHC cho thấy: mức đề kháng kháng sinh ngày một gia tăng. 1.2.4.2. Các phương pháp kỹ thuật kháng sinh đồ:  Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán (Kirby-Bauer): * Nguyên lý: các chủng vi khuẩn khác nhau có độ nhạy cảm với các loại kháng sinh ở mức độ khác nhau và được biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh có chứa một đậm độ xác định khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn với kháng sinh. * Mục đích: tìm hiểu về tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh giúp cho lâm sàng phương hướng điều trị đúng với những kháng sinh đặc hiệu, góp phần đánh giá tình hình kháng thuốc của vi khuẩn. * Các bước thực hiện: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới.  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn: (Minimum Inhibitory Concentration: MIC) * Nguyên lý: nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và bằng mắt thường có thể xác định được điều này. * Mục đích: kỹ thuật nhằm xác định chính xác nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, từ đó xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh. * Các bước thực hiện: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: - Nhóm chứng: 350 mẫu bệnh phẩm là dịch họng mũi lấy ở 350 trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi sống trên địa bàn 2 xã Vĩnh Thạnh và Vĩnh Phương của thành phố Nha Trang. - Nhóm bệnh: 441 mẫu bệnh phẩm là dịch họng mũi lấy ở 441 bệnh nhi dưới 5 tuổi mắc nhiễm trùng hô hấp cấp tính tại khoa Nhi Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh hòa. 7 2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang có phân tích. 2.2.2. Nội dung các bước nghiên cứu: 2.2.2.1. Đối với 350 mẫu bệnh phẩm lấy từ trẻ dưới 5 tuổi khỏe mạnh: - Sử dụng phương pháp PCR và PCR định lượng xác định vi khuẩn có trong bệnh phẩm. 2.2.2.2. Đối với 441 mẫu bệnh phẩm lấy từ trẻ dưới 5 tuổi mắc NTHHC: - Nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn. - Sử dụng phương pháp PCR và PCR định lượng xác định căn nguyên vi khuẩn. - Xác định mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh bằng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). - Sử dụng phương pháp PCR xác định gen kháng thuốc của S. pneumoniae và H. influenzae. - Sử dụng phương pháp Multiplex RT-PCR và Heminested PCR xác định căn nguyên vi rút. 2.2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: 2.2.3.1. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm họng mũi: theo thường qui của Tổ chức Y tế Thế giới. 2.2.3.2. Nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn: theo thường qui của Tổ chức Y tế Thế giới và Viện Y học Nhiệt đới thuộc Đại học Nagasaki - Nhật Bản. 2.2.3.3. Xác định S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis bằng phương pháp PCR và PCR định lượng * Mục tiêu của phương pháp: thiết lập một xét nghiệm nhanh, nhậy và có độ đặc hiệu cao để phát hiện và định lượng S. pneumoniae, H. influenzae và M. catarrhalis ở bệnh phẩm họng mũi trẻ khoẻ mạnh và trẻ dưới 5 tuổi mắc NKHHC dựa vào hệ thống PCR; xét nghiệm này sẽ được ứng dụng trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp ở Việt Nam. Phản ứng PCR đa mồi để phát hiện ba loại vi khuẩn S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis và ba phản ứng PCR định lượng dựa trên nguyên lý Syber Green để định lượng từng loại vi khuẩn có trong bệnh phẩm họng mũi. * Các chủng vi khuẩn:Các chủng vi khuẩn thường hiện diện ở đường hô hấp được thu thập và làm mẫu tham chiếu để phân tích tính đặc hiệu. * Các mẫu bệnh phẩm họng mũi: 350 mẫu bệnh phẩm họng mũi lấy ở trẻ dưới 5 tuổi khoẻ mạnh thuộc 2 xã Vĩnh Thạnh, Vĩnh Phương của thành phố Nha Trang và 441 mẫu bệnh phẩm họng mũi của bệnh nhi dưới 5 tuổi mắc NKHHC tại khoa Nhi Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hoà. Bệnh phẩm được lấy 8 theo thường quy của WHO. Bệnh phẩm ngay sau khi lấy được cất trong 1ml môi trường STTG (sữa tách kem, đậu nành tryptone, glycerol, glucose) và được lưu trữ ở -800C cho đến khi làm xét nghiệm. * Tách DNA: theo quy trình kit thương mại QIA mini kit. DNA của các chủng vi khuẩn tham chiếu cũng được tách bằng kít QIAamp. Sau khi tách, DNA của vi khuẩn được xác định nồng độ và độ sạch bằng máy đo quang của hãng Eppendorf AG của Đức. Các mẫu DNA sau khi tách được bảo quản ở -300C. * Thiết kế mồi: Sử dụng 3 bộ mồi cho cả phản ứng PCR đa mồi và PCR định lượng; trong đó, có 2 bộ mồi để phát hiện S. pneumoniae và M. catarrhalis được công bố bởi các nghiên cứu trước và một bộ mồi để phát hiện H. influenzae do phòng thí nghiệm chúng tôi thiết kế. Tất cả được liên kết, so sánh độ tương đồng bằng phần mềm MEGA 4.0 và trình tự primer mới được lựa chọn sao cho có ít nhất 1-4 cặp bases đầu tiên ở đầu 3’ đặc hiệu cho H. influenzae. Bộ primer sau đó được kiểm chứng lại bằng BLAST để xác định độ đặc hiệu. * Thực hiện PCR và PCR định lượng xác định S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis: Trước tiên thực hiện phản ứng PCR đa mồi để phát hiện đồng thời S. pneumoniae, H. influenzae và M. catarrhalis. Những mẫu bệnh phẩm âm tính với PCR đa mồi, được thẩm định lại bằng PCR đơn mồi. Đối với những mẫu bệnh phẩm dương tính được tiến hành xét nghiệm PCR định lượng để xác định số lượng ba loại vi khuẩn S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis. * Nhận định kết quả: đối với nhóm chứng các mẫu bệnh phẩm có vi khuẩn được coi là dương tính; nhóm bệnh các mẫu bệnh phẩm có vi khuẩn ≥ 107 CFU /1ml được coi là dương tính. 2.2.3.4. Phương pháp multiplex RT-PCR và heminested PCR xác định căn nguyên vi rút: * Sinh phẩm: - Hệ thống mồi sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền v