Tóm tắt luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

48 was suitable for cell growth of Zedoary in flask 250 mL. The cell biomass was maximum with 10.44 g fresh weight (0.66 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 3 g. 3. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; agitation speed 150 rpm/min, aeration rate 2,5 L/min was suitable to growth of Zedoary cells in 10 L bioreactor. The cell biomass was maximum with 603 g fresh weight (53.25 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 200 g. 4. The concentration of essential oil in cells reached maximum at 2.57% dry weight after 14 culture days, 1.6 times higher than that in rhizome. The concentration of curcumin in cells reached maximum at 1.16% after 14 culture days, 2.7 times higher than that in rhizome. There was a biotransformation of curcuminoid in cell culture. The concentration of polysaccharide in cell was maximum at 6.55% dry weight after 10 culture days, 1.4 time lower than that in rhizome. There was accumulation of sesquiterpenes in cell culture. The compositions of sesquiterpene distributed in suspension cells was less than that in rhizome. There were 3-4 peaks of sesquiterpene distributed similar to rhizome. There was a biotransformation of sesquiterpene in cell culture. 5. Essential oil could inhibit growth of B. cereus ATCC 11778 (31 mm), S. aureus ATCC 6538 (22.33 mm) and E. coli ATCC 25922 (18.33 mm). Overall, the antibacterial ability of essential oil derived from culture cell was high. RECOMMENDATION 1. More studies to enhance the accumulation ability of bioactive compounds in Zedoary cells. 2. More studies in composition as well as bioactivities of curcumin, sesquiterpenes, polysaccharides produced from Zedoary cells. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Thực vật là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu... Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất đã đuợc công bố. Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến động của điều kiện môi trường và địa lý, cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế để cung cấp nguyên liệu ổn định cho ngành công nghiệp sản xuất dược phẩm. Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức hiệu quả trong sản xuất các hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này như anthraquinone, vincristine, berberin, diosgenin, taxol, ginsenoside…. Nghệ đen là loài thảo dược quý, không độc, có chứa các chất như curcumin, terpenoid và tinh dầu. Curcumin của nghệ đen có khả năng ức chế khối u; chống lại một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp; 2 curcuminoid và sesquiterpen là những chất có khả năng ức chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào. Tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180), ngăn ngừa đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào. Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong tế bào cây nghệ đen nuôi cấy huyền phù. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro; - Nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen; - Khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tinh sinh học của tế bào; - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu của tế bào. 4. Những đóng góp mới của luận án - Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây 47 (22.33 mm) and finally E. coli (18.33 mm). Meanwhile, essential oil derived from rhizome can inhibit the growth of B. Cereus; E. coli; S. aureus (16 mm; 17.67 mm and 14 mm) respectively. Table 3.18. The antibacterial ability of essential oil in Zedoary cells D-d (mm) Bacteria Control Essential oil of cells Rhizome essential oil B. cereus ATCC 11778 0 22.33b 16.00a E. coli ATCC 25922 0 18.33 b 17.67a S. aureus ATCC 6538 0 31.00 a 14.00a Figure 3.14. Antibacterial ability of essential oil. A: E. coli ATCC 25922. B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: control. TN: essential oil of rhizome. TB: essential oil of cells CONCLUSION AND RECOMMENDATION CONCLUSION 1. The basic MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.8% agar; 0.5 mg/L BA and 0.5 mg/L 2,4-D was suitable to callus induction from leaf-base of in vitro Zedoary. The yellow compact and friable callus were most suitable for cell suspension culture. 2. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; shaking speed of 120 rpm/min 46 Figure 3.13. Distribution of sesquiterpene. A: Accumulation of sesquiterpene in rhizome; B: kinetics of sesquiterpene accumulation in suspension cells from day 2 to 18 3.5. Antibacterial activity of essential oil in Zedoary cells Results performed in table 3.18 indicated that, essential oil extracted from both cells and rhizome can depress growth E. coli, S. aureus and B. cereus. Overall, essential oil collected from suspension cells could be antibacterial (Figure 3.14). The essential oil from culture cells depressed most to S. aureus (31 mm), then to B. cereus 3 nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác và trong hệ lên men 10 lít. - Đã khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcummin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen. - Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về nuôi cấy tế bào cây nghệ đen và khả năng tích lũy một số hoạt chất sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học để phát triển nuôi cấy tế bào cây nghệ đen nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định để chiết tách thu hồi các hợp chất thứ cấp dùng làm dược liệu, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 105 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các phần: Phần Mở đầu có 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 32 trang; Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 7 4 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận, 36 trang; Phần Kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang, Tài liệu tham khảo: 23 trang với 193 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh; Luân án có 18 bảng số liệu và 16 hình. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo 17 tài liệu tiếng Việt và 189 tài liệu tiếng Anh với các nội dung liên quan gồm: (1) Nuôi cấy tế bào thực vật; (2) Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro; (3) Giới thiệu về cây nghệ đen. Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer. Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật. Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar. Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật cần thiết phải 45 For examples, peak 1 (retention time 4.7 min) had absorption of 6.05 mAU in rhizome but got just 2.55 mAU in suspension cells, meanwhile, peak 4 (retention time 7.5 min) in suspension cells had absorption of 7.33 mAU and 2.23 mAU in rhizome. Some peaks appeared in rhizome (5-8) were absent or trace (< 1 mAU) in suspension cells. However, in suspension cells, some new peaks appeared (not numbered) that had retention time about 6.8; 7.8; 8.2 and 9.2 min and the absorption of 1.38-4.10; 5.62-7.54; 1.70-8.41 and 1.06-8.38 mAU respectively. These resultd indicated that many biotransformation of sesquiterpene were occuring in process of cell culture, producing different sesquiterpene types compared with the rhizome control. Table 3.17. Comparision of eluted peak heights (mAU) for rhizome control and suspension cells of Zedoary at different culture times Compound number/retention time (min) Culture time (day) 1/4.7 2/5.1 3/6.0 4/7.5 5/12.7 6/13.8 7/19.2 8/20.5 9/26.7 2 2.11 - 2.49 5.99 - trace trace trace - 4 1.93 - 2.23 5.76 - trace trace trace - 6 1.15 trace 2.81 3.17 - trace - - - 8 1.06 - 1.54 3.57 - - - - - 10 1.22 - 1.02 4.05 - trace trace - - 12 1.04 trace 2.14 3.29 - trace - trace - 14 2.55 1.59 - 7.33 - trace - trace - 16 1.58 - 3.82 4.04 - trace - - - 18 2.36 1.15 1.15 5.11 - trace - trace - Rhizome 6.05 2.59 2.15 2.23 6.23 1.46 3.59 1.29 1.19 44 Figure 3.12. HPLC results of curcumin in Zedoary suspension cells from days 2 to18 3.4.4. Sesquiterpenes Study showed that the appearance of separated peaks in rhizome was more than that in suspension cells (Figure 3.13). Overall, peaks had retention time related to sesquiterpene compounds (numbered 1-9) in the rhizome and in suspension cells had different absorption spectrums (mAU), particularly peaks numbered 1 and 4 (Table 3.17). 5 quan tâm đến các yếu tố sau: Môi trường nuôi cấy như các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon và các điều kiện nuôi cấy như: cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu, sự khuấy trộn, sục khí…Trình tự của một quá trình nâng cấp điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến bình tam giác nuôi cấy lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men bằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó nâng cấp đến hệ lên men bằng thép không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L. Hệ lên men là một hệ thống nuôi cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện kiểm soát môi trường để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào và/hoặc hình thành sản phẩm. Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và trong thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; kháng nấm và vi khuẩn; kháng virus... Các hợp chất hóa học này còn được dùng nhiều trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu. Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen. Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều quốc gia. Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những thành tựu đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất dùng để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản xuất trên qui mô lớn các chất thuộc nhóm alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid và các amino acid. Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào những năm 1970 và đến nay đã đạt được một số thành công. Một trong những kết quả nuôi cấy tế bào thành công nhất đó là nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh. Ngoài ra còn có một số nghiên cứu nuôi cấy tế bào các loài cây thuốc khác như cây thông đỏ, cà gai leo, rau má, dừa 6 cạn… Nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene; curcuminoid. Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng khác. Cây nghệ đen đã được con người dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất như tinh dầu, curcumin, sesquiterpene.. của nghệ đen có các hoạt tính sinh học quý như: kháng ung thư, bảo vệ gan, kháng loét, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng nấm. Có một số công trình nghiên cứu về nhân giống in vitro ở cây nghệ đen chẳng hạn như tái sinh chồi từ callus nghệ đen; nhân giống in vitro cây nghệ đen từ chồi. Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro cây nghệ đen, một số kết quả bước đầu trong nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây nghệ đen cũng đã được công bố. Cho đến nay, công trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào với khả năng tích lũy sinh khối cao cũng như khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính học của tế bào nghê đen nuôi cấy in vitro trong hệ lên men là rất hạn chế. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tương nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen. Nguyên liệu nghiên cứu là các tế bào callus được tạo từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nuôi cấy callus Bẹ lá của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường MS có 2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0 mg/L BA để tạo callus. 2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù 2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào trong bình tam giác Khoảng 2 g callus 2 tuần tuổi được chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường MS lỏng có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L 43 speak at 1.16% before gradually decreasing from day 16 to day 18 alongs to cell growth (Figure 3.9). Overall, concentration of curcumin in culture cell with diferent culture time was higher than that in rhizome (0.43%). Bảng 3.16. Concentration of curcumin in Zedoary cells cultured in 10L bioreactor Culture time (day) Retention time (min) Peak square (mAU) Curcumin concentration (%) 2 2.09 1909 0.44g 4 1.98 2226 0.52e 6 2.05 2285 0.53e 8 2.00 2442 0.56e 10 1.97 4244 0.98b 12 1.99 4448 1.03b 14 2.07 5034 1.16a 16 1.99 3631 0.84c 18 2.07 2573 0.60d Rhizome 2.06 1868 0.43g Figure 3.10. HPLC result of standard curcumin Figure 3.11. HPLC result of rhizome 42 3.4.2. Total water soluble polysaccharide Table 3.15 showed the concentration of total water soluble polysaccharide (% dry quantity) from Zedoary cells at variety time. Overall, concentration of polysaccharide increased from 2 to 10 and reached a peak at 6.55%, 1.4 time lower than that in Zedoary (9.46%) (p<0,05). Table 3.15. Concentration of polysaccharide in Zedoary cells Time (days) Concentration of polysaccharide (%) 2 1.73e 4 2.23d 6 3.53cd 8 5.15bc 10 6.55a 12 5,76b 14 4.53c 16 2.01d 18 1.60e Rhizome 9.46g 3.4.3. Curcumin Analysis results of HPLC were performed in Figure 3.10-3.12 and Table 3.16. Standard curcumin has a retention time of 2.05 mins, one another peak has a similar retention time was found in extractive solution of rhizome (2.08 mins) and cells were cultured within different time 2-18 days (1.97-2.09 mins). Besides, extractive solution of natural Zedoary performed 2 other peaks. Of them, one peak had retention time that was similar to the second peak of culture cell (1.79 min), the another peak had a retention time of 1.21 min. The extractive solution of culture cell had the third peak with retention time of 1.6 minute. The disappearance of the third peak of 1.21 min (in extractive solution of rhizome) in vitro cells can be due to biotransformation happening in culture process. Results in Table 3.16 showed that, the concentration of curcumin (% dry weight) increased gradually from day 2 to day 14, reached 7 2,4-D và 0,5 mg/L BA, nuôi ở tốc độ lắc 100 vòng/phút để thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào. Môi trường MS lỏng bổ sung nguồn carbon khác nhau (sucrose, glucose và fructose) và các chất ĐHST BA và 2,4-D ở dạng riêng rẽ hoặc tổ hợp, nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào. 2.2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù trong hệ lên men 100 g sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) thu từ nuôi cấy lắc trong bình tam giác được đưa vào nuôi trong hệ lên men 14 L chứa 10 L môi trường MS lỏng có 3% sucrose, bổ sung 1,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA; với các điều kiện khác nhau như cỡ mẫu: 100-250 g, tốc độ khuấy: 100-200 vòng/phút và tốc độ sục khí: 1,5-3,5 L/phút. Sinh khối tế bào được thu 2 ngày một lần trong suốt 18 ngày để khảo sát khả năng sinh trưởng của chúng. 2.2.3. Xác định sinh trưởng của tế bào Sinh khối tươi của tế bào thu được bằng cách lọc chân không dịch huyền phù tế bào, sau đó rửa bằng nước cất để loại bỏ môi trường và cân xác định khối lượng tươi. Khối lượng khô của tế bào được xác định bằng cách sấy sinh khối tươi trong tủ sấy ở 500C cho đến khi khối lượng không đổi và cân. 2.2.4. Định lượng tinh