Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm

1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Khoa học công nghệ và ứng dụng của nó đời sống ngày càng được quan tâm của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Những ứng dụng của khoa học và công nghệ vào cuộc sống ngày càng thể hiện sự quan trọng của lĩnh vực này. Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần thay thế các hợp chất có nguồn gốc hóa học. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã giúp xã hội phát triển theo hướng thích ứng với tự nhiên, quá trình tổng hợp các hợp chất tự nhiên từ vi sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu. Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên được thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từ chu trình sống của chúng. So với các hợp chất được tổng hợp bằng con đường hóa học, tổng hợp bằng phương pháp sinh học có những ưu điểm vượt trội như: an toàn cho sức khỏe con người, thân thiện với môi trường và có tính chất bền vững. Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất của một polyme, nó có thể được tạo ra bằng cách sử dụng axit glutamic thông qua phương thức tổng hợp hóa học để tạo ra, cách thứ hai là sử dụng vi sinh vật có khả năng tổng hợp polyme từ quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật đó. Bản chất là một polyme có khả năng phân hủy, không độc với con người, tự nhiên nên γ-PGA đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực.Trong ngành công nghiệp xử lý môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học. Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, trong y dược γ-PGA được dùng như các chất mang, chất giữ ẩm... Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ có trong các sản phẩm nước ngoài mà có thể phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm truyền thống của Việt Nam như Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm, Chao Từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng ta cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ưu việt của vi khuẩn Bacillus cũng như các sản phẩm và vi khuẩn này tạo. Hơn nữa việc tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hướng phát triển, bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hưởng đến môi 2 trường sống. Để đáp ứng nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi khuẩn Bacillus và tạo ra những sản phẩm mới đáp ứng những nhu cầu bức thiết của xã hội hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu của luận án:  Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi sinh vật.  Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào trong các sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm  Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống.  Khảo sát và tối ưu các điều kiện nuôi cấy cho chủng lựa chọn để thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic.  Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm của axit poly γ glutamic.  Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào một số sản phẩm thực phẩm. Những đóng góp mới của luận án  Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ưu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc và đặc tính của γ-PGA.  Bước đầu ứng dụng có hiệu quả γ-PGA trong việc ổn định trạng thái, màu sắc, hương vị của nước cam và trong chế biến và bảo quản, cũng như cải thiện độ giòn, dai, màu sắc trong sản xuất giò.  Bố cục của luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng số liệu 53 hình và 130 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước; trong đó: Mở đầu (2 trang); Chương 1 Tổng quan (37 trang), Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang), Chương 3 Kết quả và thảo luận (58 trang), Chương 4 Kết luận (1 trang), Danh mục các công trình nghiên cứu với 4 bài báo đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (10 trang) Chương 1. TỔNG QUAN 3 Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và ngoài nước đề cập đến các vấn đề chính sau: 1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic 1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA 1.4 Tính chất γ-PGA 1.5 Phân loại γ-PGA 1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 1.7.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng 1.7.2. Ảnh hưởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men 1.7.3. Phương pháp lên men γ-PGA 1.8 Xác định và đánh giá chất lượng và γ-PGA. 1.8.1. Định tính và định lượng γ-PGA 1.8.2. Thu nhận và tinh sạch γ-PGA 1.8.3. Đánh giá cấu trúc và khối lượng phân tử của γ-PGA 1.8.4. Xác định khối lượng phân tử γ-PGA. 1.9 Ứng dụng γ-PGA 1.9.1. Trong lĩnh vực môi trường 1.9.2. Trong lĩnh vực y dược 1.9.3. Trong lĩnh vực nông nghiệp 1.9.4. Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Nguồn phân lập: tương Bần, tương Nam Đàn, chao Đại Bình Dương, mắm Rươi Tứ Kỳ, Natto - Nhật Bản và Thua Nao -Thái 2.1.2. Hóa chất: Agarrose (Merck), ethidium bromide, PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase (BioLabs), kit tinh sạch sản phẩm PCR (Promega), cặp mồi đọc trình tự 16SF và 16SR (Invitrogen), marker protein (hãng Sigma) 2.1.3. Môi trường nuôi cấy: môi trường LB và đặc hiệu E. 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị: Máy đo mật độ quang - Ultrospec 2000 uv/vis (Pharmacia Biotech); Máy li tâm lạnh -Avanti TM 30 Centifuge Beckman (Đức); Máy đo cấu trúc - Texture Analyser 4 TA.XT Plus (Đức); Máy đo phổ hồng ngoại Nicole 6700 FT-IR (Đức); Thiết bị lên men phòng thí nghiệm BioTron (Hàn Quốc) 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 2.2.1. Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử: sử dụng bộ kit API 50CHB (BioMérieux, Pháp) và giải trình tự gen 16S rRNA 2.2.2. Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp γ-PGA theo phương pháp đơn yếu tố 2.2.3. Phương pháp toán học - tối ưu điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực nghiệm - Box-Behnken với phần mềm Desgin Expert 2.2.4. Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh: Đo quang, HPLC, GPC, SDS-PAGE, đo độ quay cực, đo huyền phù Krop 2.2.5. Phương pháp đánh giá cảm quan. 2.2.6. Nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γ-PGA đến chất lượng giò lụa bằng phương pháp đo lực nén, lực cắt và cường lực gel. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Poly γ-glutamic. Từ các mẫu, phân lập bằng môi trường thạch LB, sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn, kết quả sau thu được 27 chủng vi khuẩn trên tổng số 40 chủng vi sinh vật qua các phương pháp hình thái, nhuộm bào tử, nhuộm gram. Tiến hành nuôi cấy 27 chủng vi khuẩn này trên môi trường đặc hiệu, thu được chủng phân lập được 7 chủng có khả năng phát triển mạnh trên môi trường đặc hiệu sau 72 h nuôi cấy. Từ 7 chủng thu được thông qua nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu E, cho thấy hai chủng B5 và T1 là hai chủng tạo ra độ nhớt lớn nhất từ 5,2 – 5,3cp. Hình 3.1. Sự tạo màng của các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu 5 Phương pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của các chủng chỉ mang tính chất định tính, được nhiều nghiên cứu sử dụng như thước đo γ-PGA. Tuy vậy chưa thể kết luận có γ-PGA trong thành phần dịch nhớt, để chứng minh trong dịch nhớt có γ-PGA, tiến hành kết tủa phần dịch nhớt và thủy phân kết tủa bằng HCL 6N, dịch sau thủy phân được đem đi thẩm tách loại muối và chạy sắc ký bản mỏng dịch sau thẩm tích với mẫu chuẩn là axit glutamic và chất hiển thị màu là ninhydrin. Kết quả cho thấy băng chạy dịch nhớt sau thủy phân từ chủng B5 chỉ xuất hiện một vết ở vị trí tương đương với vết của axit glutamic chuẩn. Điều đó chứng tỏ dịch nhớt của canh trường lên men có chứa γ-PGA. Để đánh giá chính xác hơn khả năng sinh γ-PGA, 7 chủng tạo màng trên một lần nữa được đem nuôi trên môi trường đặc hiệu và thu nhận sau 24 h. Đem đi xử lý và định lượng γ-PGA bằng đo phổ hấp thụ quang tại vùng tử ngoại. Nghiên cứu cho thấy cho thấy hàm lượng γ-PGA tạo thành cao nhất là hai chủng B5 và T1 với giá trị lần lượt là 5,564 g/l và 5,041 g/l sau 96h nuôi cấy và khả năng sinh γ-PGA mạnh nhất là thời điểm 96h của các chủng phân lập được. Dựa trên các kết quả đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-PGA bằng phương pháp phổ tử ngoại và các đặc điểm hình thái thấy hai chủng vi khuẩn có mã hiệu B5 và T1 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA lớn nhất trong số 7 chủng vi khuẩn phân lập được. Trên cơ sở đó lựa chọn hai chủng vi khuẩn B5 và T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γ- PGA. 3.2. Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA 3.2.1. Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng kit API 50CHB Dựa vào kết quả phân loại theo các đặc tính: hình thái khuẩn lạc, tế bào, khả năng sinh bào tử, khả năng nhuộm Gram, nhu cầu oxy, ảnh hưởng của pH, nồng độ muối... Đánh giá khả năng sử dụng các loại đường của 2 chủng với bộ Kit API 50 CHB và đối chiếu với phần mềm nhận dạng API PLUS để đánh giá thu được kết quả trong bảng 3.6 6 Bảng 3.6. Kết quả sử dụng carbon của vi khuẩn B5 và T1 bằng Kit API 50 CHB TT Phép thử Khả năng sử dụng TT Phép thử Khả năng sử dụng B5 T1 B5 T1 0 Đối chứng - - 25 Esculin + + 1 Glycerol + + 26 Salixin + + 2 Erythritol - - 27 Xelobiose + + 3 D-Arabinose - - 28 Mantose + + 4 L-Arabinose + + 29 Lactose + + 5 Ribose + + 30 Melibiose + - 6 D-Xylose - + 31 Saccarose + + 7 L-Xylose - - 32 Trehalose + + 8 Adonitol - - 33 Inulin - - 9 -Metyl-D-Glucozit - - 34 Melezitose - - 10 Galactose - - 35 Rafinose + + 11 Glucose + + 36 Tinh bột + + 12 Fructose + + 37 Glycogen + + 13 Manose + + 38 Xylitol - - 14 Sorbose - - 39 Gentiobiose + + 15 Rhamnose - - 40 D-Turanose + - 16 Dulxitol - - 41 D-Lyxose - - 17 Inozitol + + 42 D-TAgartose - - 18 Mannitol + + 43 D-Fucose - - 19 Sorbitol + + 44 L-Fucose - - 20 -Metyl-D-Manozit - - 45 D-Arabitol - - 21 -Metyl-D-Glucozit + + 46 L-Arabitol - - 22 N-Acetyl-Glucosamin - + 47 D-TAgartose - - 23 Amygdalin - + 48 2-ketogluconat - - 24 Arbutin + + 49 5-ketogluconat - - (+): Phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính 7 Sau khi kết hợp giữa việc đánh giá dựa trên đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phần mềm API PLUS cho thấy chủng vi khuẩn B5 có độ tương đồng với B. subtilis là 98% và độ tương đồng của vi khuẩn T1 với loài B. subtilis là 73%. 3.2.2. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử: Trình tự đoạn gen được giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3103XL, xác định được đoạn gen 16S rRNA của chủng B5 có 1250 bp và của T1 là 1516bp (phụ lục). Phân tích mối quan hệ phát sinh loài được tiến hành dựa trên thuật toán Maximum Likelihood, sử dụng phần mềm Phylogeny với dữ liệu trên ngân hàng gen NBCI, cho thấy các chủng vi sinh vật B5 và T1 đều có quan hệ gần nhất (98-99%) với loài B. subtilis. Hình 3.6. Cây phát sinh chủng (B5) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA Kết quả định danh bằng hai phương pháp hóa sinh và phương pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn B5 là chủng vi khuẩn có độ tương đồng 98-99% với B. Subtilis BA-71. Từ kết quả trên, luận án đã đề xuất định tên cho chủng vi khuẩn này là Bacillus subtilis B5. Đối với chủng T1 sau khi định danh bằng phương pháp hóa sinh cho thấy có độ tương đồng là là 73% và phương pháp sinh học phân tử cho kết quả có độ tương đồng với B. subtilis C-3-9 (98- 99%) nên chưa thể kết luận chủng T1 thuộc loài B. subtilis 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 3.3.1.Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA Những nghiên cứu về sinh tổng hợp γ-PGA cho thấy tiền chất để tạo thành γ-PGA chủ yếu là hợp chất glutamic, glutamat hay bột đậu tương. Việc bổ sung đậu tương dạng bột vào canh trường lên men không làm tăng lượng γ-PGA, không những vậy khi bổ sung đậu tương còn gây ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của vi khuẩn, ảnh hưởng đến sự hình thành của γ-PGA. Trong môi trường có chứa natri glutamat, hàm lượng γ-PGA tạo thành cao hơn trong môi trường có 8 chứa glutamic. Như vậy có thể sử dụng natri glutamat làm nguồn tiền chất trong quá trình tạo γ-PGA thay thế cho axit glutamic trong toàn bộ quá trình nghiên cứu. 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ B. subtilis là loài vi khuẩn ưa ấm có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC. Để có thể tìm ra một chế độ nhiệt thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA, tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu có natri glutamat, trong điều kiện nuôi tĩnh, lên men tại các nhiệt độ 30oC; 35oC; 40oC và 45oC và 50oC để nuôi cấy, thu nhận kết quả 24h một lần, kết thúc quá trình lên men sau thời gian 120h. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua đồ thị hình 3.9. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng B. subtilis B5 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA cao nhất ở nhiệt độ 40oC, tạo ra γ-PGA đạt giá trị lớn nhất 9,07 g/l tại thời điểm 96h lên men. 3.3.3.Ảnh hưởng của tốc độ lắc. Tốc độ lắc của quá trình lên men được khảo sát ở tốc đô từ 0 – 200 v/p, tốc độ lắc là thông số đánh giá mức độ cung cấp khí cho môi trường lên men. Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA Hình 3.10 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA Kết quả biểu diễn ở hình 3.10 cho thấy: lượng γ-PGA đạt giá trị lớn nhất ở tốc độ 0 v/p (10,36 g/l ), khi tốc độ lắc càng cao xu hướng hình thành γ-PGA càng giảm. Đối với mẫu nuôi tĩnh do không tạo áp lực tác động lên lớp vỏ tế bào, nên sự hình thành γ-PGA không bị ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho môi trường lên men trong bình tam giác của các mẫu thí nghiệm vừa đủ để vi khuẩn sinh trưởng và tổng hợp γ-PGA. Do vậy, phương án nuôi tĩnh được lựa chọn cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo trên quy mô thí nghiệm. 9 3.3.4. Ảnh hưởng của pH. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới chủng B. subtilis B5, tiến hành khảo sát ở các giá trị pH từ 5 – 9. Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và sinh trưởng của vi khuẩn B. subtilis B5 thể hiện rất rõ tại các giá trị pH = 5 và pH =9, khả năng sinh tổng hợp γ-PGA hầu là không thấy. Sự hình thành γ-PGA tăng mạnh trong khoảng pH từ 6 đến 8 trong thời gian 96h. Giá trị γ-PGA cao nhất (13,03 g/l) tại thời điểm 96h trong môi trường có pH = 8. 3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp γ-PGA. Nguồn carbon là phần cốt lõi để tạo lên bộ khung tế bào vi sinh vật giúp sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp γ-PGA, nguồn carbon phù hợp sẽ giúp sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis B5 phát triển tốt, tạo tiền đề cho sinh tổng hợp γ-PGA. Sau khi nghiên cứu lựa chọn 4 nguồn carbon là lactose, glucose, saccarose và axit citric, đã lựa chọn được nguồn carbon sử dụng là axit citric nồng độ 1,5% (15g/l) làm thông số cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. 3.3.6. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp γ- PGA với 3 nguồn nitơ thông dụng và rẻ tiền là NH4Cl, cao nấm men, NH4NO3, kết quả quá trình sinh tổng hợp γ-PGA đạt nồng độ cao nhất là 13,5 g/l khi sử dụng nguồn nitơ là NH4NO3 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ-PGA Như vậy quá trình sinh tổng hợp γ-PGA có thể sử dụng NH4NO3 làm nguồn nitơ chính cho quá trình tổng hợp γ-PGA, thay thế nguồn nitơ đang dùng trong môi trường E hiện tại là NH4Cl. 3.3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống. 10 Tỷ lệ cấp giống là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men. Tỷ lệ cấp giống cao quá hay ít quá đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp. Nghiên cứu với các tỷ lệ cấp giống đến quá trình lên men dao động trong khoảng 1% đến 15% với thời gian lên men là 96h cho thấy: Lượng giống cấp với tỷ lệ 5% cho lượng γ- PGA lớn nhất là 16,48 g/l, ở hai tỷ lệ cấp giống 1% và 15% lượng γ- PGA tạo thành nhỏ nhất dao động trong khoảng 6 g/l. Vì vậy tỷ lệ cấp giống 5% được lựa chọn làm thông số cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.8. Ảnh hưởng của nồng độ natri-glutamat Các nghiên cứu trên đã chỉ ra việc thay thế L-glutamic nồng độ 20 g/l bằng natri glutamat nồng độ 20 g/l. Sau khi thay đổi các điều kiện, môi trường, chế độ nuôi cấy, nồng độ γ-PGA tạo thành có phần cải thiện. Để tạo điều kiện cho sự hình thành γ-PGA là cực đại với nguồn tiền chất mới, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ tiền chất đến lượng γ-PGA hình thành cho thấy với nguồn tiền chất Natri – Glutamat với nồng độ 25 g/l sẽ tạo nên một lượng γ-PGA cao hơn khi sử dụng natri – glutamat ở nồng độ 20g/l và tạo thành γ-PGA = 20,5 g/l. 3.4. Tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ-PGA Dựa vào số liệu đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, thời gian, nồng độ tìền chất, pH, nguồn carbon, tỷ lệ cấp giống... và những nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành γ-PGA. Theo nguyên tắc của ma trận Box – Behnken, ta tiến hành 29 thí nghiệm với sự thay đổi đồng thời của bốn yếu tố quanh giá trị trung bình. Từ những phân tích phương sai, phần mềm đã đưa ra phương trình hồi quy theo giá trị thực của mô hình nghiên cứu như sau: Hàm lượng γ- PGA = - 2356,079 + 49,003X1 + 0,267X2 - 1,375X3 – 0,022X1X2 + 0,055X2X3 - 0,542X1X2 - 0,009X2X2 - 0,115X3X2 – 21,617X4X2 X1, X2, X3 và X4 là các yếu tố nhiệt độ, thời gian, tiền chất và pH bởi đây là những yếu tố ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA sau khi đã được khảo sát qua một số thí nghiệm. Giá trị chuẩn Fisher (F) là 24,70 và mô hình hoàn toàn có ý nghĩa với độ tin cậy 99,99% (p<0,0001), trong phép thử giá trị thông số 11 không phù hợp (Lack of Fit) giá trị p = 0,2043 (> 0,05) điều đó có nghĩa là mô hình này tương thích với thực nghiệm. Đánh giá dựa trên các giá trị hệ số xác định bội (R-square) và hệ số xác định bội hiệu chỉnh (Adj R-square), hai thông số đặc trưng cho mức độ phù hợp của mô hình trong việc giải thích các thí nghiệm. Trong nghiên cứu này giá trị R-square = 0,9611 và Adj R- square = 0,9222 đều > 0,9 điều đó chứng tỏ mô hình được lựa chọn là phù hợp để giải thích các kết quả nghiên cứu thí nghiệm. Mô hình cho thấy tương quan giữa yếu tố: nhiệt độ - thời gian; nhiệt độ - tiền chất, ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA. Hình 3.16. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi thời gian và nhiệt độ thay đổi Hình 3.17. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi nhiệt độ và tiền chất thay đổi Tối ưu hóa mô hình nghiên cứu. Hai trong 12 phương án tối ưu nhất trên lý thuyết được lựa chọn như sau: Phương án 1: Nếu xét trên góc độ tính toán để tối ưu hàm lượng γ-PGA hay nói cách khác đặt mức độ quan trọng của chỉ tiêu này đến mức cao nhất, phần mềm sẽ cho phương án sau thời gian 115,97 giờ, ở điều kiện pH ban đầu 8,04 hàm lượng tiền chất 30 g/l và nhiệt độ nuôi 39,41oC, thu được nồng độ γ-PGA cao nhất là 26,40 g/l và phương án có giá trị mong đợi (Desirability) là 0,978. Dựa trên kết quả tối ưu tiến hành thực nghiệm kiểm chứng ở nhiệt độ 39,5oC, pH = 8, nồng độ tiền chất 30g/l và với các điều kiện khác tương tự sau 116 giờ nuôi cấy nồng độ γ-PGA thu được là 26,04 g/l. Phương án 2: Nếu xét tính tối ưu để áp dụng được trong sản xuất quy mô lớn, cần phải xem xét về các yếu tố như thời gian ngắn, đầu vào nguyên liệu thấp, cho sản lượng tối ưu, tiến hành đặt các mức độ quan trọng của thời gian, tiền chất lên mức độ quan trọng nhất, sản lượng γ-PGA ở mức khá, nhiệt độ ở mức trung bình và các giá trị 12 ảnh hưởng ít là pH ở mức độ vừa phải. Sau khi chạy phần mềm tối ưu ta được các thông số nhiệt độ = 39