Ứng dụng của enzym trong nghiên cứu, phân tích và trong y học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TẬP MÔN HÓA SINH THỰC PHẨM ỨNG DỤNG CỦA ENZYM TRONG NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH VÀ TRONG Y HỌC NHÓM SVTH: PHẠM TOÀN THỨC NGUYỄN DUY PHÚC CHU LƯU QUANG VĂN MINH THIỆN NGUYỄN ANH TUẤN TỪ CHÍ HÙNG GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM Mở đầu Ngày nay công nghệ enzym ngày càng phát triến. Nhờ có nguồn gốc sinh học và các đặc điểm vượt trội so với các xúc tác vô cơ như: điều kiện phản ứng ôn hòa, tiết kiêm năng lựơng, tốc độ phản ứng nhanh, cường độ xúc tác mạnh và đặc biệt enzym có tính đậc hiệu rất cao vì thế enzym này càng được sử dụng rộng rãi. Enzym không chỉ được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất thực phẩm để tạo la nhiều loại thực phẩm phục vụ cho đời sống của con người mà nhờ vào tính chất đặc hiệu cao enzym còng được ứng dụng trong nghiên cứu phân tích và y học. Vì vậy bài báo cáo này chúng em muốn giới thiệu ứng dụng của một số enzym trong lĩnh vực phân tích và y học. Mục lục I/ ứng dụng của enzym trong nghiên cứu, phân tích enzym glucooxydaza enzym cacbonpeptydaza enzym ureaza II/ ứng dụng của enzym trong y học enzym telomeraza III. Ứng dụng của ezym trong nghiên cứu CHUƠNG I: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM TRONG PHÂN TÍCH 1.Enzym Glucooxidaza Đặc tính của enzym glucooxidaza Các nghiên cứu về cấu tạo và đặc tính của enzym glucooxidaza đã được A.Crueger và W.Crueger thực hiện năm 1990. Các tác giả kết luận enzym glucooxidaza là hợp chất glucoprotein, có ohân tử lượng khoảng 155x103 D. Glucooxidaza chứa 2 phân tử coenzym flavinadenindinucleotit ( viết tắt là FAD) và 16% khối lượng phân tử là hydratcacbon ( mannoza, galactoza và glucosamine dưới dạng N-acetyl). Enzym glucooxidaza tổng hợp từ A.niger có cấu tạo bởi 583 axit amin. Điểm đẳng điện của enzym này là pH 4,2. Enxym glucooxidaza có tính đặc hiệu rất cao, chỉ cần một thay đổi nhỏ trong cấu trúc thì hoạt lực oxy hóa của enzym đã khác hẳn nhau, ví dụ gốc glucoza trong phân tử enzym ở dạng b-D glucoza có hoạt tính oxy hóa mạnh hơn a-D glucoza 157 lần. Enzym glucooxydaza 1.2 Cơ chế xúc tác của enzym glucooxydaza Glucooxydaza thu được từ nấm mốc , khi có mặt oxy sẽ chuyển glucoza thành axit gluconic và H2O2. Glucooxydaza có tính đặc hiệu cao hầu như chỉ chuyển hóa b-D glucoza C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2 Cơ chế tác dụng như sau: Đầu tiên, nó xúc tác sự tách hai nguyên tử hydro ở cacbon thứ nhất của glucoza để tảo thành glucono – lacton: + Pr.FAD+ ® + Pr.FADH2 b - D – glucoza b- D – glucono - d - lacton Flavin khử sẽ tác dụng với oxy của không khí tạo thành H2O2 : Pr.FADH2 + O2 ® Pr.FAD + H2O2 Còn b- D – glucono - d - lacton sẽ kết hợp với nước và phân ly một cách ngẫu nhiên thành axit gluconic: + H2O ® ngu6o Thường người ta thu chế phẩm glucooxydaza ừ nấm mốc nòi penicilium và Aspergillum như A.niger , Pen.notatum, Pen. Chrysogenum, Pen.vitale. Theo cơ chế hoạt động của enxym glucooxydaza thì luôn có hình thành H2O2, chính H2O2 lại ức chế hoạt động của enzym glucooxydaza. Để giải quyết tồn tại trên người ta bổ sung một loại enzym có khả năng chuyển hóa H2O2 như enzym catalaza. Quá trình oxy hóa glucoza dưới hệ hai enzym glucooxydaza – catalaza như sau: Ứng dụng của enzym glucooxydaza Nhờ có tính đặc hiệu cao ( chỉ oxy hóa b - glucoza ) nên người ta dúng nó làm thuốc thử xác định glucoza trong hỗn hợp đường phứcc tạp và trong các hệ thống sinh học. Nguyên tắc cũng dựa trên phản ứng: `` Glucoza + oxy axit gluconic + H2O2 H2O2 + chất tiếp nhận sinh màu chất tiếp nhận sinh màu dạng oxy hóa( có màu xanh hay màu khác) Chất tiếp nhận sinh màu có thể dùng là octotoluidin hay octodianizin. Để biết luợng glucoza trong dịch sinh học một cách nhanh chóngngưới ta có thể dùng giấy chỉ thị tẩm dung dịch hai enzym. Đoạn nhúng vào dung dịch sinh học(nước tiểu) nếu có chứa glucoza thí sau 1-2 phút sẽ xuất hiện màu xanh. Hoặc được xác định tự động bằng glucooxidaza gắn đồng hóa trị với polytirol. 2. Enzym cacboxypeptydaza(EC 3.4.17) 2.1 cơ chế tác động của enzym cacboxypeptydaza Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) thuộc nhóm peptidhydrolase, xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid, phản ứng xảy ra với vận tốc lớn nếu amino acid đầu C là amino acid thơm. enzyme này cũng thủy phân liên kết este. Carboxypeptidase A có khối lượng phân tử 34,3. KDa chứa 1 mol Zn/1 mol E. Zn tham gia trong hoạt động xúc tác của enzyme. Khi thay thế Zn bằng các kim loại hóa trị hai khác làm thay đổi hoạt độ và có thể cả tính đặc hiệu của enzyme. Trong phân tử enzyme, Zn ở gần bề mặt phân tử, tương tác với gốc His - 69, His - 196 và Glu - 72. Các gốc amino acid có vai tr. xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme là: Arg - 145, Tyr - 248 và Glu - 270. Cơ chế phản ứng xúc tác của Carboxypeptidase A được xác định trên cơ sở kết quả nghiên cứu phản ứng của nó với dipeptid glycyltyrosine. Quá trình phân giải liên kết peptid có thể được phân thành các bước sau: - Tạo thành phức ES: Khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm trong trung tâm hoạt động của enzyme thay đổi vị trí trong không gian. Nhóm guanidin của Arg - 145 cũng như nhóm carboxyl của Glu - 270 dịch chuyển 2Å, nhóm hydroxyl của Tyr - 248 dịch chuyển 12Å từ chỗ gần trên bề mặt phân tử chuyền vào trong đến vùng gần với liên kết peptid của cơ chất. Tương tác giữa các nhóm chức của trung tâm hoạt động với glycyltyrosine như sau: Sơ đồ biểu diễn tương tác giữa glycyltyrosine với các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của carboxypeptidase A (cơ chất viết nét đậm) - Nhóm carboxyl tự do của cơ chất kết hợp với nhóm tích điện dương của Arg - 145 của enzyme qua liên kết ion. - Nhóm NH trong liên kết peptide của cơ chất tạo thành liên kết hydrogen với nhóm - OH của Tyr - 248. - Oxy trong nhóm - CO - của liên kết peptide tương tác với Zn, c.n carbon trong nhóm - CO - này tương tác với nhóm carboxyl của Glu - 270 qua phân tử nước. - Cắt đứt liên kết giải phóng sản phẩm. Nguyên tử Zn phân cực liên kết - CO, tăng tính ái điện tử của nguyên tử carbon, do đó làm tăng tương tác của nó với nước hoặc với nhóm ái nhân của phân tử protein enzyme. Gốc Glu - 270 hoạt hóa phân tử nước, nhóm - OH được tạo thành tấn công trực tiếp vào nguyên tử cacbon của - CO - (trong liên kết peptide của cơ chất), liên kết peptid bị kéo căng ra và bị đứt. Gốc Tyr - 248 nhường hydrogen cho nhóm NH trong liên kết peptiê cho cơ chất, giải phóng sản phẩm đầu tiên là tyrosine của cơ chất và acyl - enzyme. Cơ chế phản ứng xúc tác của carboxypeptidase A Sau khi liên kết peptide bị cắt đứt, trạng thái ion hóa của các nhóm acid và base bị biến đổi tương ứng với pH môi trường, Tyr - 248 kết hợp với proton, trở về trạng thái ban đầu. 2.2 Ứng dụng của enzym cacboxypeptydaza : Enzym cacboxypeptidaza chỉ cắt đứt liên kết peptit từ đầu cacboxyl end của phân tử protein bậc một vì vậy nó đựơc dúnng để xác định cấu trúc protein bậc một. 3.Enym ureaza(3.5.1.5) : Enzyme urease là enzyme xúc tác phân hủy ure thành amoniac và carbon dioxide. Môi trường tối ưu để enzyme hoạt động là: Enzyme Helicobacter Pylori Urease pH=7 và nhiệt độ 40°C. Enzyme Urease từ đậu Jack pH=7,4 và nhiệt độ 60°C. Enzyme urease có trong một số loài vi khuẩn, nấm men, và 1 số loài thực vật. Ví dụ: Vi khuẩn Helicobacter pylori tiết ra enzyme urease Cây đậu Jack (canavalin ensifirmis, thuộc họ đậu) chứa enzim urease đến 20% chất khô. Cơ chế: trung tâm hoạt động của enzyme là nguyên tử Ni. Ứng dụng trong thận nhân tạo. Các phân tử enzyme urease không tan trong nước, được gắn trong các vi tiểu cầu có kích thước rất nhỏ. Các vi tiểu cầu này được gắn trong các ống lọc của thận nhân tạo để phân hủy ure trong máu thành amoniac và carbon dioxide thải ra ngoài. Enzym ureaza Ngoài ra người ta cón ứng dụng một số enzym như : Điện cực ureaza không tan dùng để xác định tự động ure trên dòng liên tục enzym ureaza. Điện cực alcoloxydoreductaza không tan dùng để xác định metanol, etanol trong dung dich nước. CHƯƠNG II: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM TRONG Y HỌC 1.Enzym telomeraza 1.1Nhiễm sắc thể (Chromosome): - Mỗi nhiễm sắc thể (NST) hay các thể bắt màu (chromosome) gồm một sợi DNA và protein tạo hình thái cho sợi nhiễm sắc. NST "được gói" trong nhân tế bào. Vì DNA (mang các gene) là thành phần chính của NST nên có thể coi NST như véc-tơ truyền thông tin di truyền tới thế hệ sau. - Mỗi loài sở hữu một bộ NST đặc trưng về số lượng, hình thái, kích thước. Như đã nói ở trên, số lượng NST ổn định qua các thế hệ. 1.2Thể Đỉnh (Telomere): - Vào những năm 1930, Hermann Muller và Barbara McClintock phát hiện ra rằng điểm tận cùng ở đầu các sợi NST (các telomere hay thể đỉnh) có đặc tính ngăn các NST không dính với nhau. Không những thế đầu tận cùng còn bảo vệ NST trong các quá trình tế bào nhân đôi và phân chia. - Các nghiên cứu chứng minh rằng trình tự DNA của phần đầu NST có mặt ở hầu hết các loài động, thực vật, từ a míp cho đến người. Như vậy cấu trúc phần đỉnh NST của một loài này có thể bảo vệ NST của loài khác mặc dầu hai loài ở mức thang tiến hóa rất xa nhau. - Ngược lại, telomere hoàn chỉnh có khả năng bảo vệ NST khỏi bị tổn thương và giúp tế bào kéo dài "tuổi trẻ". Hiện tượng này được chứng minh trên các tế bào người. Các nghiên cứu sau này xác định được rằng trình tự DNA của telomere thu hút các protein hình thành những "chiếc mũ bảo hiểm" bao bọc các phần đầu dễ đứt gãy của mạch DNA. 1.3Enzyme Telomerase: - Carol Greider và giáo sư hướng đẫn vào lễ giáng sinh 1984 đã phát hiện dấu hiệu của một enzym trong dịch chiết tế bào. Enzyme được đặt tên telomerase, được tinh sạch và tiếp tục xác định cấu trúc. Một kết quả gây ngạc nhiên là telomerase gồm cả RNA và protein. Phần RNA chứa trình tự CCCCAA và đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp telomere trong khi phần protein đảm bảo cho enzym hoạt động. Enzym này kéo dài đoạn đầu mút và tạo điều kiện để DNA polymerases (enzym tác động vào quá trình kéo dài chuỗi DNA) thực hiện sao chép dọc chiều dài cho đến tận điểm cuối NST. 1.4- Ứng dụng: - Sau khi cấu tạo, cơ chế hoạt động và chức năng của telomere được tìm ra, nhiều chuyên gia cho rằng telomere đóng vai trò chính trong quá trình lão hóa không những của tế bào đơn lẻ mà còn của cả cơ thể. rong thực tế lão hóa là một quá trinh phức tạp với nhiều yếu tố liên quan và telomere chỉ là một trong những yếu tố đó. - Đa số tế bào không phân chia một cách thường xuyên nên NST của chúng gặp ít rủi ro và có vẻ ít cần đến hoạt động của telomere. Như vậy với khả năng phân chia mãnh liệt, nhiều khi vô hạn định của các tế bào ung thư, hoạt động của telomere NST phải giữ vai trò quan trọng. Một giả thuyết được đưa ra là có thể tác động, hạn chế hay kìm hãm tế bào ung thư bằng cách tác động đến telomere NST của chúng. Nghiên cứu các tác nhân hạn chế tế bào ung thư và vaccin kháng tế bào có các telomere tăng hoạt động đang được tiến hành. - Sai lệch của các telomere có thể dẫn đến một số bệnh di truyền như thiếu máu do suy tủy gây thiếu hồng cầu. Nguyên nhân của bệnh bắt nguồn từ các tế bào gốc ủy xương. Một số bệnh phổi, bệnh da di truyền cũng do sai lệch các telomere gây nên. CHƯƠNG III: ỨNG DỤNG CỦA ENXYM TRONG NGHIÊN CỨU 1.Nghiên cứu enzym của ếch để điều trị ung thư : Theo các nhà khoa học Anh và Mỹ, một enzyme trong tế bào trứng ếch có triển vọng rất lớn trong điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư não. Liệu pháp mới này đang được thử nghiệm tiền lâm sàng. Các nhà nghiên cứu thuộc Trường Đại học Bath (Anh) và công ty Alfacell (Mỹ) đã phân lập và thử nghiệm thành công amphinase, một phiên bản của enzyme ribonuclease từ tế bào trứng của loài ếch Northern Leopard (Rana pipiens). Ribonuclease là một loại enzyme có trong tất cả mọi sinh vật và có nhiệm vụ thu dọn các dải tế bào trôi tự do của phân tử RNA (ribonucleic acid) bằng cách thâm nhập vào phân tử này và cắt nó ra thành những đoạn ngắn. Ở động vật hữu nhũ, hoạt động của enzyme này được kiểm soát chặt chẽ bằng các chất ức chế nên nó không gây nguy hại gì. Nhưng amphinase là một ribonuclease của ếch – một loài động vật lưỡng cư chứ không phải loài hữu nhũ – nên amphinase vượt qua được các phân tử gây ức chế của loài hữu nhũ để phá hủy tế bào ung thư. Kết quả thử nghiệm cho thấy amphinase có khả năng nhận ra một lớp đường đặc thù trên tế bào ung thư và bám chặt vào đó, rồi tìm cách thâm nhập vào bên trong tế bào để tấn công. Khi vào được bên trong tế bào ung thư, phân tử amphinase sẽ phá vỡ hoạt động bình thường của tế bào và giết chết tế bào bằng cách làm đứt rời các chuỗi RNA – chất liệu di truyền có nhiệm vụ chuyển tải những chỉ thị của DNA đến cơ quan sản xuất protein trong tế bào. Loại enzyme có trong loài ếch Northern Leopard có tác dụng điều trị ung thư, nhất là ung thư não. Mặc dù có khả năng tiềm tàng trong điều trị nhiều bệnh ung thư, nhưng amphinase được đánh giá là mở ra cơ hội lớn nhất trong điều trị ung thư não – một loại ung thư mà chỉ có thể được can thiệp bằng phẫu thuật và hóa trị liệu rất phức tạp. Nhóm nghiên cứu hy vọng rằng amphinase sẽ dẫn đến việc ra đời của loại thuốc đầu tiên trị ung thư não. Theo giáo sư Ravi Acharya, thuộc Khoa Sinh học và Hóa sinh học của Đại học Bath, kết quả thử nghiệm cho thấy amphinase “có khả năng rất cao trong việc tìm kiếm, thâm nhập và phá hủy các khối ung thư.” Ông nói: “Đây là một phân tử hoạt động rất mạnh mẽ. Nó giống như một viên đạn kỳ diệu của Đấng Tạo hóa có khả năng nhắm vào tế bào ung thư để tiêu diệt”. Theo ông, enzyme này “có thể tổng hợp được dễ dàng trong phòng thí nghiệm và có triển vọng trở thành một loại thuốc điều trị ung thư trong tương lai”. Theo nhóm nghiên cứu, thuốc được bào chế từ amphinase sẽ được tiêm trực tiếp vào vùng có khối u và không gây hại cho các tế bào lành mạnh xung quanh, vì amphinase chỉ phát hiện và tấn công tế bào ung thư mà thôi. Tuy nhiên, giáo sư Acharya cho biết: “Việc thử nghiệm amphinase chỉ mới ở giai đoạn đầu, và phải mất vài năm nữa mới có thể có một loại thuốc như thế. Và thuốc đó phải qua những thử nghiệm lâm sàng qui mô lớn để được chứng minh là an toàn và hiệu quả trong điều trị ung thư”. Amphinase là phiên bản thứ 2 của enzyme ribonuclease do Alfacell Corporation phân lập từ trứng ếch Rana pipiens. Phiên bản đầu tiên là ranpirnase, hiện đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 trong điều trị u trung biểu mô ác tính không thể cắt bỏ được – một dạng hiếm và nguy hiểm của ung thư phổi. Hai giai đoạn thử nghiệm trước đó tập trung vào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ và các khối u cứng khác. Amphinase là phiên bản thứ 2 của enzyme ribonuclease được phân lập từ trứng ếch Northern Leopard. (Ảnh: Wikipedia) Ông Kuslima Shogen, Chủ tịch kiêm Tổng giám đốc Alfacell Corporation, cho biết “ông rất hài lòng trước thành quả tuyệt vời mà giáo sư Acharya và các cộng sự đã đạt được”.  Ông cho rằng: “Nghiên cứu này rất quan trọng đối với việc tìm hiểu và phát triển những liệu pháp mới dựa trên ribonuclease, mở ra cơ hội điều trị cho người bị ung thư hoặc mắc các bệnh nguy hiểm khác”. Hiện nay, Alfacell Corporation đang tiếp tục các thử nghiệm tiền lâm sàng đối với Amphinase trước khi chuyển sang thử nghiệm lâm sàng trong thời gian tới. 2. Máy Tính Làm Từ ADN Và Enzym: Các nhà khoa học Israel vừa chế tạo ra một máy tính có thể thực hiện 330.000 tỷ phép tính/giây, gấp 100.000 lần tốc độ của PC nhanh nhất hiện nay. Chạy bằng ADN nên máy được ghi vào sách kỷ lục Guinness là "thiết bị điện toán sinh học nhỏ nhất thế giới".  Ngay từ năm 2002, các nhà nghiên cứu của Viện khoa học Weizmann ở thị xã Rehovot (miền Trung Israel) đã sản xuất được máy tính từ các phân tử ADN và enzyme thay vì microchip. Lần này, họ chỉ dùng một phân tử ADN để cung cấp dữ liệu đầu vào và năng lượng cho thiết bị. Nếu nhìn bằng mắt thường, máy tính ADN trông giống dung dịch nước. 1.000 tỷ thiết bị có thể nằm gọn trong một giọt nước. Cấu trúc của máy tính sinh học gồm ADN đóng vai trò phần mềm và enzyme giữ vai trò phần cứng. Phản ứng hoá học giữa các phân tử trong ống nghiệm cho phép nhà khoa học thực hiện những phép tính đơn giản. Nhà khoa học ra lệnh cho thiết bị làm việc bằng cách thay đổi thành phần phân tử ADN. Thay vì xuất hiện trên màn hình, kết quả được phân tích thông qua một kỹ thuật cho phép nhà khoa học nhận biết chiều dài của phân tử ADN đầu ra. Hiện nay, máy tính ADN chỉ thực hiện được các phép tính đơn giản và chưa có ứng dụng thực tế. Theo trưởng nhóm nghiên cứu , Ehud Shapiro, thiết bị có thể kiểm tra danh sách con số, trả lời câu hỏi dạng "có/không"... Tuy nhiên, xét về tốc độ và dung lượng lưu trữ, máy tính ADN vượt xa thiết bị truyền thống. Các nhà khoa học cho biết phân tử ADN trong nhân của mọi tế bào có thể chứa nhiều thông tin trong 1 cm3 hơn 1.000 tỷ CD nhạc. Hiệu suất sử dụng năng lượng của máy tính ADN cũng gấp 1 triệu lần so với PC.Trong khi máy tính để bàn được thiết kế để thực hiện một phép tính thật nhanh thì máy tính ADN tạo ra hàng tỷ câu trả lời cùng một lúc. Điều này khiến thiết bị sinh học phù hợp với việc giải quyết các vấn đề logic mờ. Tương lai có thể xuất hiện loại máy tính lai ghép dùng silicon truyền thống để thực hiện các nhiệm vụ thông thường và những bộ đồng xử lý ADN để giải quyết nhiều vấn đề phức tạp.Điện toán ADN trên thế giới vẫn đang ở giai đoạn sơ khai. Tuy nhiên, nó có thể thay đổi tương lai của máy tính, đặc biệt là cá ứng dụng về sinh y học và dược học. Một số nhà khoa học dự đoán rằng bác sĩ sẽ đưa máy tính ADN vào cơ thể người để kiểm tra sức khoẻ. Thiết bị sẽ phun thuốc để điều trị những mô bị tổn hại."Máy tính siêu nhỏ" sinh hoá tồn tại trong mọi sinh vật nhưng con người gần như không thể kiểm soát chúng, ví dụ không thể lập trình cây xanh để tính toán số pi. Ý tưởng sử dụng ADN để lưu trữ và xử lý thông tin xuất hiện từ năm 1994 khi một nhà khoa học Mỹ lần đầu tiên dùng ADN trong ống nghiệm để giải quyết một vấn đề toán học đơn giản. TÀI LIỆU THAM KHẢO: Lê Ngọc Tú,2005, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa Học Kỹ Thuật. Thuvienkhoahoc.com Journal of Molecular Biology Wissermen A. (1969), Handbook of Enzyme Biotechnology. Second Edition, Macmillan Publishing Company, New york.