Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi

MỤC LỤC CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU 3 CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 4 Giới thiệu về cây đu đủ 4 2.1.1. Giới thiệu 4 2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ 5 2.1.3.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 5 2.2 Giới thiệu về enzyme papain 5 2.2.1 Cysteine protease 5 2.2.2 Nguồn gốc 5 2.2.3 Tính chất của papain 5 2.2.3.1 Tính chất vật lý 6 2.2.3.2 Tính chất hóa học 7 a) Cấu tạo hóa học: 7 b) Cấu trúc không gian 8 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain 9 d) Phản ứng của papain 11 e) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 13 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 14 3.1 Phương pháp thu nhận papain 14 3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ 14 3.1.2 Thu nhận papain 14 3.2 Phương pháp tinh sạch papain 15 3.2.1. Điện di 15 3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75 15 CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 17 4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 17 4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân 17 a/ Nguyên lý chung: 17 b/ Thuyết minh quy trình chung: 18 4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân 18 4.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 19 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành 19 4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính 20 a. Cơ chất: 20 b. Điều kiện: 20 c. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 20 c.1. Khái quát 20 c.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain 21 4.2 Một số ứng dụng của enzyme papain 25 4.2.1 Trong y học 25 4.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 25 4.2.3 Trong các ngành công nghiệp khác: 26 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN 28 Tài lệu tham khảo 29 CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase. Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài ra, papain còn là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trường hơi kiềm hay trung tính. Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho được 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm.... Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi. CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ Giới thiệu Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da. 2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan. 3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng. 4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó. 5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu. 6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain. 2.2 Giới thiệu về enzyme papain 2.2.1 Cysteine protease - Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động. - Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. - Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide. 2.2.2 Nguồn gốc Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm. 2.2.3 Tính chất của papain 2.2.3.1 Tính chất vật lý Bảng 2.1: Tính chất vật lý của papain Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 Độ triền quang [α]D -66.70 Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt. 2.2.3.2. Tính chất hóa học a) Cấu tạo hóa học: Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton. Bảng 2.2: Thành phần hóa học: Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng Alanine 13 Lyeine 9 Arginine 10 Proline 4 Aspartic acid 17 Serine 9 Half – Cysteine 6 Threonie 11 Glutamid acid 17 Tryptophan 7 Glycine 23 Tyrosine 5 Histidine 2 Valine 17 Isoleucine 10 Methionine 15 Leucine 10 0 Tổng cộng: 185 Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25. b) Cấu trúc không gian Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C. c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain - Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. - Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys. - Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys. Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser. Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng: - Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. - Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid: (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH à (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)-CO-)k i+k=n - Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid (H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH à (H2N-CH(R)-COOH)n` + (H2N-CH(R)-CO-)k n`+k = n - So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxy tự do. Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain. - Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase. Hoạt hóa papain: Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. Bất hoạt: - Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. - Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m). d) Phản ứng của papain Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 1000C. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn. Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 370C. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 1150C trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%. pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút. Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain. CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN Sơ đồ quy trình công nghệ: 3.1 Phương pháp thu nhận papain Nguyên liệu 180g nhựa đu đủ Celite(100g) Nghiền 200-300m dd cysteine 0.04M Cát sạch(150g) pH: 5.7 Bã Trích ly Bã Lọc 110mlNaOH 1M Chỉnh pH Lọc Tủa xám (NH4)2SO4 Kết tủa phân đoạn 1 Thời gian: 1-2 giờ Dịch lỏng 400-500ml (NH4)2SO4 Ly tâm 1 60g NaCl rắn Kết tủa phân đoạn 2 pH : 7-7.5 Dịch lỏng thời gian: 1 giờ Ly tâm 2 Kết tinh pH: 6.5 dd NaCl bão hòa Tái kết tinh Thời gian: 30phút t: 370C Sấy chân không t: 400C Papain. 3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ: Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95%. 3.1.2 Thu nhận papain: Chuẩn bị: Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất. cách làm như sau: Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để đư pH dịch chiết tới 5.7) Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11. Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh. Loại bỏ các chất không tan pH9: Thêm từ từ và khuấy đều 1 lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong. Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4: Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/ phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại lấy chymopapain. Tủa được rửa lại 1 lần nữa với 400-500ml dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa. Quá trình phân đoạn bằng NaCl: Hòa tan trong 600mL dung dịch cysteine 0.02M, dung dịch thu được có pH 7- 7.5 sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau 1 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dich lỏng. Kết tinh Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M ở nhiệt độ phòng được 1 dung dịch huyền phù có pH = 6.5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể. Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất nhiệt độ phòng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ ( đồng thời khuấy đều) dung dich NaCl bão hào ( 10mL/ 300mL dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền phù được giữ ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ thu nhận tinh thể. Hoạt động riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm 1 lần nữa như trên. Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0 và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc. Sấy chân không Sấy chân không ở nhiệt độ 400C thu nhận papain tinh chế. 3.2 Phương pháp tinh sạch papain 3.2.1. Điện di: Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm là beta-alanine 34mM, pH = 4.3 và cường độ dòng điện không đổi là 4mM. mẫu sẽ được chuẩn bị trong Tris-glycerol-beta-mercatoethanol cho vào nước sôi trong 40 giây. Gel sẽ được hiện màu bằng thuốc thử Coomassie-Blue R-250 và Brilliant Blue G-colloidal. 3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75: Để xác định phân tử lượng của papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có kích thước cột là 1.1x100 cm. cột được cân bằng trước dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0.1M và dung dịch EDTA ( ethylenediamine-tetraacetic aicd) pH=7. CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân Bánh dầu đậu phộng xay nhuyễn Enzyme papain (khô) t: 1500C pH : 8-8.5 thời gian: 2 giờ Thủy giải dd đệm phosphate 0.1M Lọc hoặc ly tâm Bã sau lọc Dịch lọc O2, O3, H2O2, iodur acetate Sản phẩm thu được dạng dung dịch loãng Bất hoạt enzym Cô đặc Sản phẩm đậm đặc hoặc khô Sơ đồ thủy phân. a/ Nguyên lý chung: Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình khá phức tạp. Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham gia phản ứng theo sơ đồ sau: E + S à ESàS + P - Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu phộng), sau đó mới diễn ra sự thủy giải