Ứng dụng phương pháp pcr - Genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (wssv) trên tôm sú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ đã tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội học tập thêm những kiến thức thực tế. Chân thành cảm ơn anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khoá 14) đã nhiệt tình hỗ trợ cung cấp mẫu tôm thu ở Cà Mau năm 2008. Xin cám ơn tập thể các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy Sản. Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và em gái đã động viên trong suốt thời gian làm luận văn cũng như trong khoảng thời gian học Đại học. Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành công trong cuộc sống. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm hiểu sự khác nhau về kiểu gen của WSSV ở hai thời điểm và hai khu vực khác nhau bằng phương pháp PCR - Genotyping (ORF94 và ORF125). Kết quả cho thấy có sự khác nhau về kiểu gen của WSSV ở năm 2006 và năm 2008 và cả ở 2 khu vực Cà Mau và Bạc Liêu khi phân tích 231 mẫu ở 23 ao, thuộc 2 đợt thả giống liên tiếp trong cùng một ao nuôi ở mô hình quãng canh cải tiến (QCCT) thuộc tỉnh Cà Mau 2008 và so sánh kiểu gen của các dòng virus này với các nghiên cứu trước đây (năm 2006). Kết quả nghiên cứu cho thấy, năm 2008, kiểu gen thuộc ORF94 có 12 nhóm vùng lặp lại (VLL), từ 4 - 16 vùng lặp lại trong đó 11-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (35,8%, 43/120 tổng số mẫu), ORF125 có 8 nhóm vùng lặp lại từ 3 - 14 vùng lặp lại, trong đó 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (53,8%, 64/119 tổng số mẫu). Năm 2006 cho thấy có 5 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125, từ 4 - 8 vùng lặp lại (Cà Mau) và có 6 nhóm từ 3 - 8 vùng lặp lại (Bạc Liêu), trong đó kiểu gen có 6-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất ở cả hai khu vực (Cà Mau là 59,7%, Bạc Liêu là 24,1%). Sự nhiễm nhiều kiểu gen (ORF94 và ORF125) của WSSV trong cùng 1 ao ở mô hình nuôi QCCT năm 2008 là phổ biến và sự nhiễm kép nhiều kiểu gen trong cùng một mẫu tôm cũng phong phú hơn so với năm 2006. Nghiên cứu còn cho thấy, sự nhiễm bệnh ở các đợt nuôi tôm liên tiếp ở mô hình QCCT chủ yếu là do nguồn tôm giống gây ra. Từ đó có thể thấy khả năng ứng dụng tốt phương pháp PCR Genotying trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................... ……………………………………….i TÓM TẮT .................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH ................................................................................. vi Chương I - GIỚI THIỆU ............................................................................ 1 Chương II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 3 2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm .................................................. 3 2.1.1 Trên thế giới .............................................................................. 3 2.1.2 Ở Việt Nam ............................................................................... 4 2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV .............. 5 2.2.1 Hình thái học của WSSV ........................................................... 5 2.2.2 Cấu trúc protein ......................................................................... 5 2.2.3 Gen và phân loai học.................................................................. 6 2.2.4 Sự biến đổi về gen và độc lực của các dòng virus....................... 7 2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm .................................................................... 7 2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật PCR - genotyping ................................................................. 8 2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR .......................................................... 9 2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR ......................................................... 9 2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR .................... 9 2.3.3 Úng dụng của kỹ thuật PCR ..................................................... 10 Chương III - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................. 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 11 3.2.1 Dụng cụ và hoá chất .............................................................. 11 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................ 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 12 3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV ........................... 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping ................................................. 14 Chương IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 16 4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008 .......................................................... 16 4.1.1 Kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000 .................................... 16 4.1.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping ......................................... 19 4.1.2.1 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF94 .............. 19 4.1.2.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF125 ............ 25 4.2 Kết quả phân tích mẫu axit nucleic trử năm 2006 với PCR-Genotyping thuộc ORF125 .............................................................................. 30 4.3 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 ............................................... 33 4.4 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 ............................................... 35 Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................. 38 4.1 Kết luận ......................................................................................... 38 4.2 Đề xuất .......................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 39 PHỤ LỤC I .............................................................................................. 42 PHỤ LỤC II ............................................................................................. 43 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 - Tỉ lệ nhiễm bệnh so với tổng số mẫu phân tích ........................... 16 Bảng 4.2 - Các ao có mẫu tôm và mẫu cua dương tính được phân tích ......... 18 Bảng 4.3 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 .... 19 Bảng 4.4 -Số vùng lặp lại của ORF94 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu ............................................................................................................. 24 Bảng 4.5 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 ...................................................................................................... 25 Bảng 4.6 - Số vùng lặp lại của ORF125 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu ........................................................................................................ 29 Bảng 4.7 - Kết quả phân tích số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu axit nucleic trử ở Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 ........................................ 32 Bảng 4.8 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 33 Bảng 4.9 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 34 Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 35 Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 ................................................................................................ 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996) .......................... 5 Hình 4.1 - Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5% ................. 17 Hình 4.2 - Các vùng lặp lại thuộc ORF94 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 ....... 20 Hình 4.3 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống đợt 1 ............................................................................................. 21 Hình 4.4 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống đợt 2 ............................................................................................. 21 Hình 4.5 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 ..... 26 Hình 4.6 - Sự nhiễm kép của WSSV trong cùng một mẫu thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 ........................................................................ 26 Hình 4.7 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi đợt 1 .................................................................................................... 27 Hình 4.8 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi đợt 2 ..................................................................................................... 27 Hình 4.9 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở 2 tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 .................................................................................. 30 Hình 4.10 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Bạc Liêu năm 2006 . 31 Hình 4.11 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2006 ... 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 Chương I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long trong đó, Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng theo thống kế là 3 vùng nuôi tôm lớn ở Miền Nam Việt Nam với nhiều mô hình nuôi phong phú đa dạng. Tuy nhiên, khi dịch bệnh xảy ra (bắt đầu xuất hiện vào năm 1994 và kéo dài đến nay) do nhiều nguyên nhân khác nhau đã dẫn đến thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Trong đó, bệnh đốm trắng là một trong những bệnh gây thiệt hại đáng kể đến năng suất tôm nuôi. Bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus (WSSV) gây ra trên tôm xuất hiện sớm nhất ở Đài Loan năm 1991, sau đó thì phân bố rộng khắp nơi ở các khu vực nuôi tôm trên thế giới. WSSV gây bệnh trên tôm nước mặn, tôm nước ngọt và được phát hiện nhiễm trên nhiều đối tượng khác nhau. Từ khi bệnh xuất hiện đến nay có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về phương thức lan truyền, vật chủ cảm nhiễm, độc lực, thành phần cấu tạo và đã hoàn thành về phân loại học WSSV, vv,…và đặc biệt đã giải trình tự bộ gen ba dòng WSSV ở Đài Loan, Trung Quốc và Thái Lan. Khi so sánh 3 bộ gen này với nhau, tìm thấy sự thay đổi về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 trên 3 dòng virus này. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, vai trò ứng dụng của việc tìm hiểu sự thay đổi kiểu gen thuộc ba vùng mã hoá này là rất lớn. Theo nghiên cứu của Dieu et al., (2004) và Hoa et al., (2005) cho thấy dựa vào sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 của WSSV có thể xác định được nguồn gốc, phạm vi lan truyền của bệnh từ nơi phát sinh và cũng như sự khác nhau của các dòng WSSV. Do đó, các vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu về dịch tể học của WSSV ở Việt Nam. Vì vậy, đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR Genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú” được thực hiện nhằm mục tiêu: Tìm hiểu các vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú thu ở Bạc Liêu và Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 Nội dung nghiên cứu - Phân tích các dòng WSSV thu ở Bạc Liêu và Cà Mau (năm 2006 và 2008) với phương pháp PCR genotyping (thuộc ORF94 và ORF125) - So sánh sự khác nhau về kiểu gen vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu ở năm 2006 và 2008. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 Chương II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm 2.1.1 Trên thế giới Trong khoảng thời gian 1991 - 1992 bệnh đốm trắng xuất hiện và gây chết nhiều tôm nuôi ở một tỉnh của Đài Loan và sau đó đến hai tỉnh của Trung Quốc. Đến năm 1994, bệnh này lan rộng và xâm nhập vào các trại nuôi ở nam Nhật Bản, Thái Lan, Indonesia và bờ biển phía tây của Ấn Độ. Sau đó một năm, bệnh xuất hiện ở cả khu vực Thái Bình Dương đã làm thiệt hại nặng, sau 3 năm bệnh lan khắp nơi trong các trại nuôi qui mô nhỏ ở Bắc Mỹ. Từ năm 1998 đến 1999 bệnh bắt đầu xuất hiện ở Nam Mỹ, đầu tiên là ở Ecuador sau đó là Peru và tiếp tục đến các nước ở khu vực Thái Bình Dương. Không quá 10 năm bệnh xuất hiện và lan rộng khắp toàn cầu, gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế. Ước lượng rằng qua 10 năm bệnh đã làm thiệt hại khoảng 20 - 30 tỉ USD.(Trích dẫn từ Caleb McClennen, 2004). Khi bệnh xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 1992, sản lượng tôm giảm trên 70%, thiệt hại hơn 2 tỉ USD trong 3 năm liên tiếp. Đến năm 2001 Trung Quốc lại thiệt hại trên 200.000 triệu tấn. Ước đoán tổng thiệt hại lên tới là 15 tỉ USD. Ở Thái Lan, sản lượng thiệt hại khoảng 34.000 triệu tấn/năm. Cho đến năm 1994 làm sản phẩm tồn lại khoảng 265.000 triệu tấn, thiệt hại khoảng 1,6 tỉ USD. Ở Indonesia cũng có tình trạng tương tự, sản lượng tôm khi bệnh chưa bộc phát là 17.000 triệu tấn/năm từ 1985 - 1991. Khi bệnh xuất hiện làm nền công nghiệp bị đình trệ gây tổn thất gần 1 tỉ USD trong 10 năm. Ở Ấn Độ và sau đó là Philippines cũng bị thiệt hại khá nặng khi bệnh bộc phát. Ở Châu Mỹ Latin, dịch bệnh bùng nổ vào năm 1999. Bệnh xảy ra đầu tiên ở Nicaragua nhưng chỉ ở mức nhỏ làm giảm 13% sản lượng, thiệt hại vài triệu USD. Tuy nhiên, ở các quốc gia lân cận thì không may mắn. Ở Ecuador sản lượng giảm hơn 60% trong 2 năm, kết quả là làm thiệt hại hơn 1 tỉ USD từ 1998 - 2001. Ở Panama, sản lượng giảm nhanh gần 90%, trong 3 năm gây thiệt hại trên 100 triệu USD. Tương tự, ở Peru sản lượng trong 2 năm giảm gần 90%, kết quả là thiệt hại 70 triệu USD. Vào thời điểm này các nhà khoa học có nhiều nghiên cứu để làm rõ các ổ dịch ở nhiều vùng khác nhau xảy ra ở Mỹ Latin để đối phó lại sự bộc phát của WSSV. (Trích dẫn từ Caleb McClennen, 2004) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 2.1.2 Ở Việt Nam Vào giữa năm 1994, bệnh tôm xuất hiện và xảy ra khắp các tỉnh phía Nam đã gây thiệt hại lớn về kinh tế. Theo báo cáo kết quả NTTS năm 2003 cho thấy, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Chủ yếu là bệnh virus đốm trắng, bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Ở các tỉnh Bắc Trung Bộ theo các số liệu do Trung tâm Môi trường và Dịch bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I) cho thấy: Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh, thường là bệnh do virus đốm trắng, tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như Khu công nghiệp Hoằng Phụ với 70/110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Nghệ An có 9,1- 47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh virus đốm trắng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh có 67 ha bị bệnh virus đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, cũng có đến hơn 100 ha nuôi tôm bị bệnh. Tại các tỉnh miền Trung và Nam Trung Bộ, theo Phòng Bệnh học thủy sản (Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III), địa phương có tỷ lệ diện tích nuôi tôm bị bệnh thấp nhất là Khánh Hoà (14,3%), cao nhất là Ninh Thuận (52,4%). Tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này có giảm. Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Bệnh do virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt làm tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khu vực ( banvebenhtom.htm). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV 2.2.1 Hình thái học của WSSV WSSV có hình que, màng bao khép kín. Vỏ virus dài khoảng 210 - 380 nm và rộng nhất khoảng 70 - 167 nm. Có một đuôi phụ nằm ở cuối của virion, đôi lúc không quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996). Màng bao của virus dày 6 - 7 nm và có 1 lớp lipid, cấu trúc của màng với 2 lớp trong suốt phân biệt được nhờ vào 1 lớp đục. Nucleocapsid nằm ở phía trong màng bao gồm có các protein hình cầu với đường kính 10 nm. Khi phóng thích khỏi màng bao, nucleocapsid tăng thêm chiều dài và nằm trong virion. Kích cở của nucleocapsid thay đổi tuỳ theo loài nhưng chiều dài thường trong khoảng 180 - 420 nm và chiều rộng 54 - 85 nm, với bề dày của thành tế bào là 6 nm. Lỏi nhân gồm có ADN gắn với protein VP15 và ADN của virion nằm trong vỏ nucleocapsid (Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008). 2.2.2 Cấu trúc protein Protein của WSSV có hơn 40 loại. Một vài protein không có cấu trúc, có liên quan đến việc kiểm soát sự phiên mã (VP9), virus sinh sản được qui định từ bản sao là ADN. Có ít nhất 38 protein cấu trúc nằm trên virion. Trên màng bao là 21 loại, 10 loại ở nucleocapsid và 5 loại nằm trên vỏ (nằm giữa màng bao và nucleocapsid). Một tế bào phụ giử chức năng xâm nhập của virus được tìm thấy ở màng bao protein VP31, VP110 và VP281. Vỏ protein VP36A và nucleocapsid VP664 và VP136A. Các protein khác như VP28, VP39B, VP41A, VP41B, VP51A, VP51B, VP68, VP124, VP150, VP187, VP281, VP292 và một protein tạo keo nằm trên màng bao. Trong khi các protein VP35, VP466, VP15, VP51, VP76 và những protein khác nằm ở nucleocapsid. Các protein này có chức năng khác nhau. Khi phân tích ở mức độ tế bào sử dụng kháng thể để liên kết với các protein lạ cho thấy rằng nó làm tỷ lệ chết của tôm diễn ra chậm hơn, điều này chứng tỏ các p