Ứng dụng phương pháp PRC phát hiện vi khuẩn aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (pangasianodon hypophthamus ) bị bệnh xuất huyết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LƯƠNG MỸ THUẬN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT Cần Thơ, 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LƯƠNG MỸ THUẬN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần thơ, 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM ƠN Được làm và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp là mong muốn của các sinh viên. Để hoàn thành tốt luận văn này là cả một quá trình học tập, phấn đấu cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô và anh chị. Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường. Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng đã nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang và anh Lê Hữu Thôi cùng các bạn lớp bệnh học thủy sản K31, đặc biệt là bạn Mai Thị Loan lớp BHTS-K31 đã nhiệt tình quan tâm giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian thực hiện đề tài. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. Đồng thời cũng so sánh với kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E. Đề tài được thực hiện trên 7 chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập trực tiếp từ cá tra bị bệnh xuất huyết ở các cơ quan (gan, thận và tỳ tạng) của 3 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp), A. hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E sau đó trữ trong glycerol (50%) ở -20oC. Sau khi phục hồi trên môi trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA và nuôi tăng sinh trong NB, DNA được chiết tách theo Bartie et al (2006), chiết tách bằng 2 cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong NB và vi khuẩn trên đĩa NA pha loãng với nước muối sinh lý). Phản ứng PCR được khuếch đại DNA theo Panangala et al (2007) có chỉnh sữa bởi Đặng Hoàng Oanh và ctv (2008). Kết quả điện di sản phẩm PCR của 7 mẫu DNA chiết tách từ NB và 7 mẫu DNA chiết tách bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý, có sự hiện diện của vi khuẩn A. hydrophila, tất cả đều hiện vạch ở vị trí 209 bp. Điện di sản phẩm PCR của 7 chủng A. hydrophila mà không qua bước chiết tách DNA, do không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại được DNA của A. hydrophila, kết quả cả 7 mẫu đều không hiện vạch khi điện di. Phản ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp nhất có thể phát hiện A. hydrophila là 1ng/µl (hàm lượng DNA). Phương pháp PCR với hàm lượng thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉ cho phép phát hiện A. hydrophila hiện vạch ở (209 bp), khi thử tính đặc hiệu với các chủng (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E. ictaluri, Pseudomonas putida, Eschericchia coli). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. i TÓM TẮT ...................................................................................................... ii MỤC LỤC ..................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... vi Chương 1: GIỚI THIỆU ................................................................................. 1 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .............................................................. 3 2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam ......................................................... 3 2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản ........................................... 3 2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh ................................................................. 4 2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra ............................................................................ 5 2.5 Sơ lược về vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá tra ............................ 7 2.6 Phương pháp PCR .................................................................................... 9 2.6.1 Khái niệm về PCR ................................................................................. 9 2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR ............................... 11 2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản ......................................... 12 2.6.4 Đối chứng ............................................................................................ 13 2.6.5 Hạn chế của PCR ................................................................................ 13 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 15 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 15 3.1.1 Thời gian ............................................................................................. 15 3.1.2 Địa điểm .............................................................................................. 15 3.1.3 Nội dung thực hiện .............................................................................. 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 15 3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ ............................................................................... 15 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm ............................................................................ 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 16 3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển ....................................................... 16 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 3.3.2 Nguồn vi khuẩn ................................................................................... 16 3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn ........................................................... 17 3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn ............................... 18 3.3.5 Phương pháp PCR ................................................................................ 18 3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR .................................. 20 3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR........................... 21 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 22 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A. hytrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết ... 22 4.2 Kết quả phục hồi vi khuẩn ...................................................................... 23 4.3 Phát hiện vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp PCR ...................... 24 4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. ....................... 26 4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. ................ 27 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 30 5.1 Kết luận .................................................................................................. 30 5.2 Đề xuất ................................................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 31 PHỤ LỤC 1 .................................................................................................. 34 PHỤ LỤC 2 .................................................................................................. 35 PHỤ LỤC 3 .................................................................................................. 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (Panangala et al., 2007). ............................................................................................................ 16 Bảng 3.2: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài. ........................ 17 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình PCR phát hiện A. hydrophila. ................................................................ 19 Bảng 4.1: Bảng kết quả thu mẫu cá tra bị bệnh. ............................................. 22 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR .................................................................. 10 Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất huyết và mắt lồi đục). .................................................................................... 22 Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar + Ampicillin. .......................................................................................... 23 Hình 4.3Hình khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường NA…………… 23 Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ....................................... 24 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng A. hydrophila ................. 25 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của chủng A. hydrophila. ..................................................................................... 26 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A. hydrophila xác định độ nhạy của phương pháp. .................................................................................. 27 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện A. hydrophila. ........................................................................ 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 Chương 1 GIỚI THIỆU Ngày nay nghề nuôi thủy sản đặc biệt là cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là một thế mạnh hàng đầu được nuôi ở các tỉnh như: Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long,… Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, về thị trường trong và ngoài nước, đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn. Nên mật độ và diện tích nuôi cá tra ngày càng tăng đáng kể. Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước. Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, khối lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với cùng kỳ năm 2006 (Báo Cần Thơ, 2007). Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất, do chi phí đầu tư thấp hơn nghề nuôi cá tra bè, mức độ thâm canh cao có thể lên đến (50-60 con/m2 ao), đã làm nẩy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh do khó quản lý tốt môi trường nước ao nuôi. Ở Việt Nam, đầu năm 2006 các tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài nguyên và môi trường Việt Nam, 2006; trích lược bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006). Cá tra là một loài cá kinh tế và khi có dịch bệnh đã gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên cứu về bệnh trên cá tra đã được triển khai như: nghiên cứu về bệnh đốm trắng ở nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan, 2006), bệnh trùng quả dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng da (Phạm Thanh Hương, 2006), nghiên cứu khả năng gây bệnh của Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (Ngô Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang (Phan Khắc Huy, 2008),… Bệnh xảy ra trên cá tra do nhiều tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng,…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, khó điều trị và gây tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra. Các loại bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột, trắng gan trắng mang, trắng da trắng đuôi,… Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas là một trong những bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra (Ngô Minh Dung, 2007). Hiện nay phương pháp chuẩn đoán vi khuẩn nói chung và A. hydrophila nói riêng, gây bệnh trên cá tra ở nước ta dựa vào dấu hiệu bên ngoài và phương PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E, không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Cũng như Ngô Minh Dung (2007) gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra, sau đó tái định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1 tuần để đọc kết quả, hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lương Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn mất khoảng 2 ngày để có kết quả. Cụ thể Nguyễn Trúc Phương (2008) đã ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết quả định danh vi khuẩn sau khi dùng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E để định danh E. ictaluri trên cá tra, đã kết luận phương pháp PCR cho phép phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn chỉ cần 1 ngày, Nguyễn Hà Giang (2008) cũng đã ứng dụng phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila sau khi đã định danh nhưng chưa cho kết quả tốt. Do đó để chẩn đoán nhanh và chính xác vi khuẩn A. hydrophila trên cá giúp cho người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do vi khuẩn này gây ra, thì ứng dụng phương pháp PCR. Nên đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp phát hiện vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh ở cá tra. Mục tiêu nghiên cứu Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết. Nội dung nghiên cứu - Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết. - Xác định độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. - Xác định tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), cho biết 7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD, tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái. Trong đó, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm 32,8%; cá tra-ba sa chiếm 31,9%; còn lại là các loại thủy sản khác. Theo Thứ trưởng Bộ NN-PTNT Lương Lê Phương, 5 doanh nghiệp ở ĐBSCL gồm: Nam Việt, Agifish, Hùng Vương, Vĩnh Hoàn và Cafatex thống nhất sẽ liên kết với nhau để nâng giá xuất khẩu cá tra, ba sa lên 5% trên thị trường thế giới nhằm đẩy giá nguyên liệu tăng lên. Đây có thể xem là mức giá sàn để áp dụng cho các doanh nghiệp xuất sản phẩm ra bên ngoài, tránh tình trạng cạnh tranh bán giá thấp (Huỳnh Phú Trọng, 2008). Tình hình nuôi thủy sản ở ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 400.000 ha mặt nước nuôi thủy sản với tổng sản lượng hằng năm lên đến hơn 1,5 triệu tấn, chiếm hơn 70% sản lượng thủy sản nuôi của cả nước (riêng cá tra, basa diện tích nuôi toàn vùng gần 5.000 ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng 1 triệu tấn). Diện tích mặt nước NTTS ở khu vực ĐBSCL tăng nhanh trong những năm gần đây. Năm 2000 là 445.300 ha với tổng sản lượng NTTS là 365.141 tấn; năm 2002 là 570.300 ha, sản lượng 518.743 tấn; năm 2004 là 658.500 ha, sản lượng 773.294 tấn; năm 2005 là 685.800 ha với sản lượng khoảng 983.384 tấn. Quy hoạch NTTS đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi thủy sản nước mặn-lợ là 649.430 ha, NTTS nước ngọt là 366.590 ha cho thấy NTTS ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội khu vực ĐBSCL (Phạm Đình Đôn, 2006). Song song với việc tăng diện tích và năng suất NTTS thì vấn đề dịch bệnh thủy sản ngày càng diễn biến phức tạp và đa dạng do nhiều tác nhân. 2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản Diện tích và mật độ nuôi thủy sản ngày càng tăng, làm cho môi trường nước càng bị ô nhiễm do chất thải từ các ao nuôi. Cùng với sự ô nhiễm do chất thải từ con người góp phần làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm nặng hơn. Đối với nuôi cá nước ngọt, lượng thải ít nhiều còn phụ thuộc vào thức ăn đưa vào chăn nuôi (thông thường 1,5-2 kg thức ăn/1 kg sản phẩm), ngoài ra còn lượng thức ăn dư thừa lắng xuống tạo ra nguồn chất thải rất dễ phân hủy hữu cơ gây ô nhiễm môi trường là nguy cơ phát sinh và lây lan dịch bệnh. Cùng với tác PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 động môi trường do chất thải trong sản xuất chế biến công nghiệp, cũng góp phần tác động đến chất lượng môi trường nước ảnh hưởng đến cả kinh tế và môi trường sinh thái (Phạm Đình Đôn, 2006). Mặt khác do nước ta nằm trong khu vực diễn biến thời tiết ngày càng phức tạp, ảnh hưởng đến môi trường nuôi thủy sản làm cho động vật thủy sản dễ bị sốc. Cuối năm 2007, chương trình phát triển của Liên Hiệp Quốc đã xác định: Việt Nam là 1 trong 5 vùng bị tác hại của biến đổi khí hậu nặng nề nhất thế giới. ĐBSCL là vùng đất thấp ven biển Đông của Việt Nam nên sẽ là khu vực bị tác hại nặng nề nhất do biến đổi khí hậu (Lệ Thu, 2008). Theo các nhà khoa học, 10 năm qua, diện tích NTTS ở ĐBSCL đã tăng hơn 2,37 lần, sản lượng tăng vọt lên 3,68 lần nhưng cũng làm cho nguồn nước bị ô nhiễm nặng, đe dọa sự mất cân đối trong chiến lược qui hoạch thủy lợi hiện nay. Ước tính mỗi năm, hoạt động NTTS đã thải ra môi trường nước xấp xỉ 4 triệu tấn bùn ở dạng chất thải hữu cơ gần như chưa được xử lý. Mầm bệnh từ các ao nuôi cũng đã đi theo nguồn chất thải này ra hệ thống sông rạch làm chất lượng nhiều vùng nước suy giảm nặng nề. Thực tế cho thấy nuôi cá tra, cá ba sa trong ao hầm, chỉ có khoảng 17% thức ăn được cá hấp thụ, phần còn lại khoảng 83% hòa lẫn, lắng đọng trong môi trường nước thành chất hữu cơ phân hủy đã làm cho môi trường bị suy thoái (Trần Khánh Linh, 2007). 2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh Theo Từ Thanh Dung (2005). Thời kỳ ủ bệnh: Đây là thời kỳ từ khi nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể đến lần thứ nhất xuất hiện triệu chứng bệnh, lúc này triệu chứng bệnh bình thường của cá bị thay đổi. Trong thời kỳ ủ bệnh sinh vật ký sinh tìm cách tích lũy dinh dương để tăng cường độ sinh sản và hoạt động, ký chủ tạo ra những yếu tố miễn dịch phòng vệ. Thời kỳ dự phát: Là thời kỳ chuyển tiếp từ lúc xuất hiện bệnh đầu tiên đến bệnh lý rõ ràng, thời kỳ này tác nhân gây bệnh tác động đến cơ quan của cá. Thời kỳ thịnh vượng: Thời kỳ bệnh phát triển cao nhất, dấu hiệu bệnh lý rõ ràng, quá trình trao đổi chất, hình thái cấu tạo, các tổ chức cơ quan bên trong biến đổi. Thời kỳ khỏi bệnh: Thời kỳ này nếu cơ thể chống chịu tốt vớ