Bài giảng thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm

B GIÁO D C & ÀO T O TR NG I H C K THU T CÔNG NGH TP.HCM KHOA MÔI TR NG & CÔNG NGH SINH H C





 BÀI GI NG TH C HÀNH PHÂN TÍCH ÁNH GIÁ CH T L NG TH C PH M Biên so n: KS. PH M MINH NH T ThS. BÙI C CHÍ THI N - 2009 - GI I THI U Trong xã h i ngày nay, i s ng c a con ng i ngày càng c nâng cao và nhu c u v n u ng càng ph i c c i thi n. Tuy nhiên, cu c s ng c a con ng i càng c nâng cao thì th i gian dành cho vi c n u ng càng gi m xu ng. Chính vì th , nh ng b a n nhanh, nh ng quán c ơm v a hè là nh ng l a ch n thích h p i v i nh ng con ng i b n r n. Do ó, vi c ánh giá và qu n lý ngu n th c ph m là iu ht s c c n thi t có th h n ch t i a kh n ng ng c th c ph m. ây chính là ti n ra i môn h c Phân tích ánh giá ch t l ng th c ph m, góp ph n giúp cho sinh viên có cái nhìn khái quát v nh ng nguyên nhân gây ng c th c ph m ng th i bi t c các ph ơ ng pháp phân tích, ánh giá ch t lng c a ngu n th c ph m. Và n i dung th c hành c a môn h c này giúp cho sinh viên có th t tay mình có th phân tích và ánh giá m c v sinh an toàn c a th c ph m i v i m t s các ch tiêu vi sinh v t và m t s các ch tiêu hóa lý th c ph m. Trong n i dung c a môn th c hành này, sinh viên s c làm quen v i quy trình phân tích các ch tiêu vi sinh nh quy trình nh l ng tng vi sinh v t hi u khí, coliform t ng s , Staphylococcus aureus , quy trình nh tính E. Coli, Salmonella . Các quy trình phân tích này d a trên tiêu chu n ngành và tiêu chu n Vi t Nam và các quy trình này c ng c áp d ng r ng rãi khá nhi u phòng thí nghi m vi sinh t i các c ơ quan, công ty. Thông th ng, các quy nh v vi sinh v t hi n di n trong m u th c ph m thông th ng cho phép có s hi n di n c a TPC, coliform t ng s và S. aureus vi s l ng nh t nh do ó ph i ti n hành nh l ng còn i v i hai ch tiêu E. Coli và Salmonella tuy t i không c phép hi n di n trong th c ph m nên ch c n phân tích nh tính. Tôi hy v ng sau môn h c thc hành này, sinh viên s tích l y c ít nhi u ki n th c th c t v phân tích ánh giá ch t l ng th c ph m và hy vong nó s tr thành mt ph n trong hành trang các b n b c vào i. 2 MC L C PH N 1 : KI M NGHI M VI SINH V T GÂY B NH TRONG TH C PH M Bài s 1 : nh l ng t ng s vi sinh v t hi u khí (TPC) trong th c ph m Bài s 2 : nh l ng t ng s Coliform trong th c ph m Bài s 3 : nh tính E. Coli trong th c ph m Bài s 4 : nh l ng Staphylococcus aureus trong th c ph m Bài s 5 : nh tính Salmonella trong th c ph m PH N II : KI M NGHI M HÓA LÝ TH C PH M Bài s 6 : Ph ơ ng pháp phát hi n nhanh màu c và không c Bài s 7 : Xác nh hàm l ng ch t béo trong s a theo ph ơ ng pháp Adam – Rose – Gottlieb Bài s 8 : Xác nh hàm l ng protein trong s a theo ph ơ ng pháp k t t a Bài s 9 : Xác nh m nguyên li u Bài s 10 : Ph ơ ng pháp phát hi n nhanh hàn the 3 PH N I KI M NGHI M VI SINH V T GÂY B NH TRONG TH C PH M 4 CÁC QUY T C AN TOÀN TRONG PHÒNG KI M NGHI M VI SINH Thao tác an toàn là yêu c u c c k quan tr ng trong ki m nghi m vi sinh v t. Khi làm vi c v i vi sinh v t, chúng ta th ng thao tác v i s l ng r t l n và m c t bào vi sinh v t ( m c 10 9 t bào/ml). Nhi u ch ng vi sinh v t là tác nhân gây b nh nên c n luôn luôn c n th n v i t t c các ch ng ang thao tác.M t khác, nhân viên ki m nghi m c ng ph i s d ng nhi u lo i hóa ch t, trong ó có các acid ho c nh ng hóa ch t có c tính. Do v y, cn tuân th m t s quy t c an toàn m b o an toàn cho b n thân và cho nh ng ng i khác trong phòng thí nghi m nh sau: - Nm v ng nguyên t c, ph ơ ng pháp làm vi c v i vi sinh v t. - Không n u ng, hút thu c trong phòng ki m nghi m. Mang kh u trang khi thao tác v i vi sinh v t. - Mc áo blouse trong th i gian làm vi c. - Tr c khi b t u làm c n sát trùng m t bàn b ng gi y lau t m c n 70 0 ho c dung d ch ch t di t khu n khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), khô. Th c hi n t ơ ng t cho hai tay. Chú ý ch a t èn c n ho c èn Bunsen khi tay ch a khô cn. L p l i vi c sát trùng này sau khi hoàn thành công vi c. - Cn ghi chú tên ch ng, ngày tháng thí nghi m lên t t c các h p petri, ng nghi m môi tr ng, bình nuôi c y. - Khi l tay làm , nhi m vi sinh v t ra n ơi làm vi c, dùng kh n gi y t m ch t di t khu n lau k , sau ó th c hi n kh trùng l i bàn làm vi c. - Cn th n khi thao tác v i èn c n ho c èn Bunsen. T t ng n l a khi ch a có nhu c u s d ng ho c ngay sau khi th c hi n xong m i thao tác. L u ý tránh a tay, tóc qua ng n l a. C n có cách b o v tóc thích h p tr ng h p tóc dài. - S d ng qu bóp cao su khi thao tác ng hút nh l ng (pipette), không hút bng mi ng. - Khi làm v d ng c th y tinh, c n th n mang g ng tay thu gom t t c m nh v vào m t túi rác riêng. - Tách riêng ch t th i r n và ch t th i l ng. - Tt c ch t th i r n, môi tr ng ch a ho c nhi m vi sinh v t c n c h p kh trùng tr c khi th i b vào các bãi rác. Các d ng c , bình ch a nhi m vi sinh v t c n c ngâm vào dung d ch ch t di t khu n (n c javel) tr c khi r a và tái s d ng. 5 - Cn gói ho c ràng b ng b ng keo khi t ch ng các h p petri lên nhau. - Không m h p petri và dùng m i ng i tránh nhi m vi sinh v t vào ng hô hp. - Khi t que c y có dính sinh kh i vi sinh v t, c n t vòng ho c u que c y vào chân ng n l a tránh s v ng nhi m vi sinh v t vào không khí. - Sát trùng và r a tay s ch s tr c khi r i phòng thí nghi m. 6 Bài s 1 : XÁC NH T NG S VI SINH V T HI U KHÍ (TPC) ----------------------------------- 1.1. nh ngh a Vi sinh vt hi u khí là nh ng vi sinh v t t ng tr ng và hình thành khu n l c trong iu ki n có s hi n di n c a oxy phân t . T ng s vi khu n hi u khí hi n di n trong mu ch th m c v sinh c a th c ph m. 1.2. Nguyên t c Tng s vi sinh v t hi u khí c m b ng cách a và trong iu ki n hi u khí 30 0C/72h + 6h ho c 37 0C/48h + 6h 1.3. Môi tr ng s d ng - Môi tr ng pha loãng m u: Saline Pepton Water (SPW) ho c Buffer Pepton Water (BPW) - Môi tr ng nuôi c y: Plate Count Agar (PCA) 1.4. Dng c - a petri - ng nghi m - T m 30 0C 1.5. Quy trình phân tích 25g m u + 225ml SPW  ng nh t trong 30 giây  pha loãng 10 -1 Pha loãng trong n c mu i sinh lý  pha loãng 10 -2, 10 -3, 10 -4 T m i pha loãng c y 1ml trên 2 a petri vô trùng. Sau ó môi tr ng PCA ã c làm ngu i n 45 0C Lc u và ch a th ch ngu i  úp ng c  em nhi t 30 0C trong 72h 7 c k t qu các k t qu t 25 – 250 khu n l c Tính toán k t qu : N A =------------------------------------ n V f + …+ n V f 1 1 1 i i i 1.6. Thuy t minh quy trình 1.6.1. Chu n b m u Cân chính xác 10 g (ho c 25 g) m u cho vào bao PE vô trùng, sau ó thêm vào 90 ml (ho c 225 ml) dung d ch pha loãng m u. Ti n hành ng nh t m u b ng máy d p mu (stomacher). Th i gian d p m u tùy thu c vào t ng lo i m u nh ng không quá 2,5 phút. T t c các thao tác trên ph i th c hi n trong iu ki n vô trùng. Khi ó, ta s có c dung d ch pha loãng là 10 -1. Dich pha loãng s c pha loãng theo dãy th p phân b ng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuy n 1ml vào ng nghi m ch a 9ml dung d ch pha loãng  ng nh t, ta s có c d ch pha loãng 10 -2. Ti p t c th c hi n t ơ ng t có c các pha loãng c n thi t. 1.6.2. a Ch n 2 hay 3 pha loãng liên ti p d ki n ch a t 30 – 300 t bào vi sinh v t. Dùng micropipette v i các u tip vô trùng chuy n 1ml d ch pha loãng vào gi a a petri vô trùng. T ơ ng ng v i m i pha loãng c y t 2 – 3 a. Sau khi c y, vào mi a 10 – 15ml môi tr ng PCA ã n u ch y và làm ngu i n 45 – 50 0C. Tr n u mu vào môi tr ng b ng cách xoay tròn a petri xuôi và ng c chi u kim ng h t 3 – 5 l n. t a lên m t ph ng ngang cho th ch ông c 1.6.3. Các a c l t ng c l i và nuôi 30 0C trong 72 gi 1.6.4. c k t qu 8 Hình 1: Tng s vi sinh v t hi u khí m t t c các khu n l c xu t hi n trên các a sau khi . Ch n các a có s m t 30 – 300 t bào vi sinh v t tính. M t t ng vi sinh v t hi u khí trong 1g m u c tính nh sau: N A (CFU/g) = n1Vf 1 + … + n iVf i Trong ó: A: s t bào vi khu n (khu n l c) trong 1g m u N: T ng s khu n l c m c trên các a ã ch n n: s l ng a c y t i pha loãng th i V: th tích d ch m u (ml) c y vào môi tr ng f: pha loãng t ơ ng ng 9 Bài s 2 : XÁC NH T NG S COLIFORMS -------------------------- 2.1. nh ngh a Coliforms Coliforms là nh ng tr c khu n gram âm, không sinh bào t , hi u khí ho c k khí tùy nghi, có kh n ng lên men lactose sinh acid và sinh h ơi 37 0C trong 24 – 48 gi . Nhóm coliforms hi n di n kh p n ơi trong t nhiên, trong ru t ng i và ng v t. Coliforms c xem là nhóm vi sinh v t ch th : s l ng hi n di n c a chúng trong th c ph m, n c hay các loi m u môi tr ng c dùng ch th kh n ng hi n di n ca các vi sinh v t gây b nh khác. 2.2. Nguyên t c Mu ã c ng nh t c c y m t l ng nh t nh lên môi tr ng th ch ch n lc thích h p ch a lactose. Sau khi 37 0C + 1 0C trong 24 – 48 gi , m s l ng khu n l c Coliforms in hình. Xác nh l i b ng các ph n ng c tr ng. Môi tr ng ch n l c Coliforms là môi tr ng ch a lactose, ây là ngu n carbon duy nh t, ng th i môi tr ng còn ch a mu i m t nh m t tác nhân ch n l c và các tác nh n ch th nh neutral red, crystal violet. Kh ng nh các dòng khu n l c c tr ng b ng môi tr ng canh ch n l c nh canh BGBL. 2.3. Môi tr ng s d ng - Môi tr ng Tryptone Soya Agar (TSA) - Violet Red Bile Agar (VRB) - Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) 2.4. Dng c - a petri - ng nghi m - ng Durnham - Chai th y tinh 250 ml - T m 37 0C 2.5. Quy trình phân tích   -1 25g m u + 225ml SPW ng nh t trong 30 giây pha loãng 10 10 T m i pha loãng c y 1ml trên 2 a petri vô trùng. Sau ó môi tr ng TSA ã c làm ngu i n 45 0C và ch trong 30’ môi tr ng VRB lên môi tr ng TSA nhi t 37 0C trong 24h Ch n và m các khu n l c có màu n s m, có qu ng t a mu i mt, ng kính > 0.5 mm m i a ch n 3 – 5 khu n l c c tr ng c y sang môi tr ng BGBL 37 0C + 0,5 trong 24 gi T l xác nh n R : S khu n l c sinh h ơi trong BGBL R = --------------------------------------------------- S khu n l c ã c y Tng s Coliforms (cfu/g) N A = --------- x R nVf 11 2.6. Thuy t minh quy trình 2.6.1. Chu n b m u Quá trình chu n b m u t ơ ng t nh ph n nh l ng t ng s vi sinh v t hi u khí. Nh ng quá trình pha loãng m u sao cho trong 1ml dung d ch pha loãng m u ch a kho ng <100 khu n l c 2.6.2. Cy m u Cy chuy n 1ml d ch pha loãng m u ã ch n vào a petri, m i n ng c y ít nh t vào 2 a và ch n 2 n ng pha loãng liên ti p c y sao cho sau khi m i a xu t hi n t 10 – 100 khu n l c. Cho vào m i a ã c y m u 5ml môi tr ng TSA ã c un ch y và làm ngu i n 45 0C, tr n u d ch m u v i môi tr ng b ng cách xoay tròn a petri xuôi và ng c chi u kim ng h . n nh nhi t phòng trong 1 – 2 gi ph c h i kh n ng c a Coliforms . thêm 10 – 15ml môi tr ng VRB. Ch môi tr ng ông c, l t ng c a và 37 + 1 0C trong 24 gi . 2.6.3. c k t qu Ch n các a có s m t 10 – 100 khu n l c Coliforms tính. Khu n l c Coliforms có màu n m và ng kính >0,5mm, xung quanh khu n l c có vùng t a mu i m t Hình 2: Khu n l c Coliforms trên môi tr ng VRB 2.6.4. Kh ng nh Quy trình kh ng nh th c hi n nh sau: ch n 5 khu n l c nghi ng trên a ã m c v i các hình d ng khác nhau c y chuy n sang môi tr ng canh BGBL và 37 0C trong 24 gi . Ph n ng d ơ ng tính khi vi sinh v t sinh khí trong ng Durnham. T l xác nh n là t s gi a s khu n l c cho k t qu d ơ ng tính v i s kh n l c kh ng nh 12 Hình 3: Kt qu kh ng nh Coliforms trên môi tr ng BGBL 2.6.5. Tính toán k t qu Da vào s khu n l c m c và t l xác nh, tính m t c a Coliforms theo công th c: N A (CFU/g hay CFU/ml) = x R n1vf 1 + … + n ivf i Trong ó: N: t ng s khu n l c m c ni: s a có s khu n l c c ch n t i m i pha loãng v: th tích c y vào m i a fi: pha loãng có s khu n l c c ch n t i các a m R: t l xác nh n Kt qu Coliforms c làm tròn ch n ch c và c bi u di n d ng s m có c ơ s th p phân. 13 Bài s 3 : NH TÍNH E.COLI ---------------- 3.1. nh ngh a Coliforms là nh ng tr c khu n gram âm, không sinh bào t , hi u khí ho c k khí tùy nghi, có kh n ng lên men lactose sinh acid và sinh h ơi 37 0C trong 24 – 48 gi . Coliforms ch u nhi t là coliforms có kh n ng lên men lactose, sinh acid và sinh hơi nhi t 44 0C trong 24 – 48 gi . Coliforms phân (feacal Coliform) là coliform nhi t có th nghi m indol trong môi tr ng tryptom d ơ ng tính. E.Coli là coliforms phân có nghi m pháp IMViC l n l t là + + - -. 3.2. Nguyên t c Ph ơ ng pháp này dùng nh tính và k t lu n phát hi n hay không phát hi n E.Coli trong m t kh i l ng m u xác nh. Cy m u vào môi tr ng t ng sinh (BGBL), ki m tra trên môi tr ng phân l p (EMB) và th nghi m b ng các ph n ng sinh hóa phù h p (nghi m pháp IMViC) 3.3. Môi tr ng s d ng - Môi tr ng TSA - Canh BGBL - Môi tr ng EMB - Canh Trypton - Canh MR - VP - Th ch Simmon Citrate - Thu c th Kovac’s - Thu c th Methyl Red - Thu c th α-naphtol 5% - KOH 40% 3.4. Dng c - a petri - ng nghi m - ng Durnham - B iu nhi t 44 0C - T m 37 0C 14 3.5. Quy trình phân25 g m tíchu + 225 ml SPW, ng nh t m u trong 30 giây  pha loãng 10 -1 Ly 1 ml m u pha loãng 10 -1 cho vào 10 ml môi tr ng BGBL 0 44 C + 0,5 trong 24 gi Ch n các ng sinh h ơi c y chuy n sang môi tr ng EMB. Mu không sinh h ơi c coi l à âm tính E. Coli 0 37 C + 0,5 trong 24 gi Khu n l c c tr ng c a E. Coli trên EMB: tròn l i, ng kính <0,5mm, có ánh kim tím Cy chuy n sang TSA  37 0C + 0,5 trong 24 gi Cy vào môi tr ng 1 trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate 37 0C + 0,5 trong 24 gi S d ng các lo i thu c th test th nghi m IMViC Kt lu n 15 3.6. Thuy t minh quy trình 3.6.1. Chu n b m u Chu n b m u t ơ ng t nh bài 1 3.6.2. Tng sinh Cy 1ml d ch m u ã pha loãng n ng 10 -1 vào ng nghi m ch a 10ml canh BGBL, 44 0C trong 24 gi . 3.6.3. Phân l p Sau 24 gi , ch n các ng nghi m cho ph n ng d ơ ng tính (môi tr ng c và có sinh h ơi) và c y chuy n sang môi tr ng phân l p EMB. 37 0C trong 24 gi Nh n d ng khu n l c E.Coli : khu n l c tròn, màu tím, có b u, ng kính 0,5 mm, có ánh kim tím. Hình 4: Khu n l c c tr ng c a E.Coli trên môi tr ng EMB 3.6.4. Kh ng nh Nh ng khu n l c nghi ng c th c hi n qua các b c th nghi m sinh hóa (th c hi n nghi m pháp IMViC). Ch n ít nh t 2 khu n l c nghi ng t môi tr ng phân l p c y chuy n sang môi tr ng r n không ch n l c (môi tr ng TSA), 37 0C trong 24 gi . Các th nghi m sinh hóa c dùng kh ng nh E.Coli nh sau: 1 2 3 4 Hình 5: Các th nghi m sinh hóa (1): Th nghi m Indole (2): Th nghi m Methyl red 16 (3): Th nghi m Voges – Proskauer (4): Th nghi m Citrate STT Th nghi m sinh hóa Kt qu 1 Indol + 2 Methyl Red + 3 Voges Proskauer - 4 Kh n ng s d ng citrate - 3.6.5. Báo cáo k t qu Phát hi n hay không phát hi n E.Coli trong 10 g (25 g) m u 17 Bài s 4 : NH L NG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ---------------------- 4.1. Nguyên t c Cy trang mt l ng m u xác nh trên b m t môi tr ng th ch ch n l c. Sau khi và m nh ng khu n l c có các c im c tr ng và không c tr ng c a S. aureus . Xác nh n các khu n l c ã m b ng ph n ng coagulase và các c tr ng khác. K t qu c xác nh b ng s khu n l c ã m, th tích c y, n ng pha loãng và h s xác nh n. 4.2. Môi tr ng s d ng - Môi tr ng BP - Môi trng TSA - Huy t t ơ ng th 4.3. Quy trình th c hi n 25g m u + 225ml SPW  ng nh t trong 30 giây  pha loãng 10 -1 Ly 1 ml m u pha loãng 10-1 cho vào a môi tr ng BP có b sung egg yolk  c y trang nhi t 37 0C trong 48h KL c tr ng c a S.aureus trên BP: tròn, l i, có tâm en và có qu ng sáng bao quanh Ch n 5 KL c tr ng c y chuy n trên môi tr ng TSA Cy chuy n vào ng nghi m ch a 0,2 ml huy t t ơ ng th 18 0 37 C và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 gi . N u không có bi u hi n ng ng kt s ti p t c n 24 gi . Xác nh t l ng ng k t R Tng s S. aureus (cfu/g) N S = --------------- nVf 4.4. Thuy t minh quy trình 4.4.1. Chu n b m u Chu n b m u nh t ơ ng t bài 1 4.4.2. Cy m u Dùng micropipette chuy n 0,1ml d ch m u ã pha loãng vào môi tr ng BP. Dùng que c y tam giác trang u trên b m t cho n khi khô. Th c hi n l p lai 3 a BP mi n ng pha loãng. 37 0C trong 48 gi i v i môi tr ng BP. 4.4.3. c k t qu Sau 48 gi , trên môi tr ng Baird Parker khu n l c S. aureus có ng kính kho ng 0,5 – 1 mm, l i, en bóng, có vòng sáng r ng kho ng 1 – 2 mm bao quanh. ánh d u trên m t áy c a a có các khu n l c có các c im trên và ti p t c n 48 gi . Sau 48 gi , các khu n l c S. aureus có ng kính kho ng 1 – 1,5 mm, vòng sáng r ng kho ng 2 – 4 mm. Có m t s dòng S. aureus không t o các khu n l c có các c im trên. C n m và ánh d u c 2 d ng khu n l c. Hình 6: Khu n l c c tr ng c a S.aureus trên môi tr ng BP 4.4.4. Kh ng nh 19 Trên môi tr ng BP: Ch n 5 khu n l c c tr ng và 5 khu n l c không c tr ng t môi tr ng BP cy vào môi tr ng TSA. 37 0C trong 24 gi . C y sinh kh i vi sinh v t vào ng nghi m ch a môi tr ng huy t t ơ ng th . 37 0C. Theo dõi ph n ng ông t huy t t ơ ng trong 2, 4, 6, 8, 24 gi . Tính t l kh ng nh trên các khu n lc c tr ng và không c tr ng. 4.4.5. Tính toán k t qu S l ng S. aureus trong m u c tính nh sau: 10 S S. aureus